Razvoj inducibilnega promotorja za izražanje heterolognih genov v bakteriji Streptomyces rimosusKužnik, Raja (Avtor) Petković, Hrvoje (Mentor) streptomiceteStreptomyces rimousheterologno izražanjeoksitetraciklinmCherryfluorescencaabsorbancapromotorski sistemStreptomyces rimosus je industrijsko pomemben mikroorganizem, ki omogoča učinkovito proizvodnjo sekundarnih metabolitov. V zadnjem desetletju pa postaja zanimiv tudi kot gostitelj za biosintezo heterolognih proteinov. Cilj magistrskega dela je bil razvoj in optimizacija na oksitetraciklin-inducibilnega promotorskega sistema Potr v sevih S. rimosus, ki ne vsebujejo biosintezne poti oksitetraciklina (OTC). Kot poročevalski gen smo uporabili mCherry, izražanje pa smo spremljali z merjenjem fluorescence. V obsegu poskusov smo testirali različne koncentracije OTC in časovne točke indukcije, ter preučevali njihov vpliv na rast sevov in količino proizvedenega heterolognega proteina. Ugotovili smo, da je optimalna koncentracija induktorja v območju 50–250 µM, pri čemer je bila najvišja stopnja izražanja poročevalskega gena dosežena, ko je bila izvedena indukcija z OTC med 2. in 12. uro kultivacije od inokulacije kulture v produkcijski fazi rasti. Pri sevih z dodatno 145 kb delecijo v genomu smo opazili povečano produkcijo heterolognega proteina, kar nakazuje na sprostitev metabolnih virov za heterologno izražanje. Največji titer heterolognega proteina je bil 22 mg/L (± 2 mg/L). Intenzivnejšo biosintezo proteina so imeli sevi, ki imajo poleg delecije biosintezne genske gruče za sintezo OTC, v genomu tudi dodatno 145 kb delecijo. Analiza izločanja proteina iz celice je pokazala, da se okoli 80 % heterolognega proteina izloči iz celic, kar nakazuje na učinkovito delovanje sekrecijskega sistema Sec.20252025-12-12 07:15:08Magistrsko delo/naloga176867VisID: 272343COBISS_ID: 262791171sl