Priprava analoga histidina in njegova rekombinantna uvedba v izbrane proteineMohar, Teja (Avtor) Gazvoda, Martin (Mentor) histidinazahistidinfluorescentni proteinifluorescencaZeleni fluorescentni protein (GFP) je globularni protein, ki ima strukturo β-sodčka, znotraj katerega se spontano tvori kromofor. Gradijo ga aminokislinski ostanki Ser65-Tyr66-Gly67, ki v notranjosti spontano ciklizirajo, takšen kromofor pa je vir močne fluorescence. V modrem fluorescentnem proteinu (BFP) je aminokislinski ostanek Tyr66 zamenjan s histidinskim, kar vpliva na fotokemijske lastnosti proteina. Histidin je esencialna aminokislina z imidazolno stransko verigo, ki omogoča funkcije, ki drugim aminokislinam niso na voljo, saj lahko preklaplja med nevtralnim in pozitivno nabitim stanjem pri fizioloških pogojih, kar mu omogoča vrsto različnih interakcij. S pomočjo z bakrom-katalizirane reakcije vodikovega azida in L-propargil glicina lahko pripravimo njegov analog azahistidin. Tega lahko selektivno vgradimo v izbrane proteine namesto histidina. V sklopu diplomske naloge smo z molekulskim kloniranjem pripravili ekspresijska vektorja z zapisoma za tako imenovana superfolder GFP (sfGFP) in superfolder BFP (sfBFP), sintetizirali azahistidin in ga s pomočjo avksotrofnih bakterijskih sevov vgradili v oba proteina, pripravili pa smo tudi njuni nemodificirani verziji. Fluorescentnim proteinom s histidinskimi ali z azahistidinskimi ostanki smo pomerili fluorescenco pri različnih pH vrednostih. Pri sfGFP-ju s histidinom smo dobili vzbujevalni vrh pri ~480 nm in emisijski vrh pri ~510 nm. Intenzivnost fluorescence je z naraščujočim pH naraščala do pH 9, nato pa je ta nekoliko upadla. Z zamenjavo histidinskih ostankov z azahistidinskimi se je pojavil dodatni ekscitacijski vrh pri ~390 nm. Nastanek tega je posledica prehoda tirozinskega ostanka v kromoforju iz deprotonirane v nevtralno obliko. Zamenjava histidinskih aminokislinskih ostankov v azahistidinske je vplivala na spekter kljub temu, da sfGFP ne vsebuje histidinskega aminokislinskega ostanka v samem kromoforju. His148 se nahaja neposredni bližini kromoforja in zamenjava tega je najverjetneje povzročila nastanek nekoliko bolj kislega okolja, kar je vplivalo na fluorescenco. Pri sfBFP-ju s histidinskimi ostanki sta se vrhova pojavila pri ~380 in 450 nm. Intenzivnost fluorescence je bila najvišja pri pH 8. Z zamenjavo histidinskih ostankov z azahistidinskimi pa se je fluorescenca močno zmanjšala oz. izničila, saj smo tokrat zamenjali aminokislinski ostanek v samem kromoforju.20252025-12-04 11:26:38Diplomsko delo/naloga176580VisID: 25675COBISS_ID: 260010755sl