Priprava mutant proteina toplotnega šoka 90β in določitev vezavne afinitete zaviralcev s termoforezo na mikroskaliMencin, Amadeja (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) Cingl, Jernej (Komentor) proteini toplotnega šokaHsp90βmutagenezazaviralci C-končne domenetermofereza na mikroskaliRakava obolenja sodijo med vodilne vzroke prezgodnje umrljivosti, pri čemer demografski trendi napovedujejo nadaljnje povečanje njihove pojavnosti. To poudarja potrebo po odkrivanju novih tarčnih učinkovin in potrjevanju že znanih na novih tarčah. Pri ohranjanju celične stabilnosti ima pomembno vlogo sistem za uravnavanje celične proteostaze, v katerem delujejo molekulski šaperoni, zlasti proteini toplotnega šoka. Eden najpomembnejših je protein Hsp90β, ki zaradi svoje vloge pri vzdrževanju tumorskega fenotipa predstavlja obetavno tarčo v razvoju novih protirakavih zdravil. Do sedaj so raziskave večinoma temeljile na razvoju zaviralcev N-končne domene Hsp90, vendar so zaradi toksičnosti in indukcije odziva na toplotni šok vse bolj v ospredju alternativne strategije, usmerjene na C-končno domeno. Ko-kristalna struktura kompleksa nekovalentnega zaviralca C-končne domene s Hsp90 še ni bila eksperimentalno določena, kar ovira nadaljnji razvoj. Kot ključno interakcijo za vezavo v predlaganem vezavnem žepu so identificirali ionsko interakcijo med bazičnim centrom spojine in aminokislinskim ostankom glutaminske kisline na mestu 489 v zaporedju proteina. Z mestnospecifično mutagenezo s prekrivajočima nukleotidoma smo vnesli dve mutaciji, s katerima smo spremenili omenjeno interakcijo. Za kloniranje smo uporabili ekspresijski plazmid pET28 z zapisom za heksahistidinsko oznako in sev E. coli TOP10 One ShotTM, za izražanje pa ekspresijski sev NiCo21 (DE3). Proteine smo izolirali in očistili na sistemu ÄKTA z uporabo kolon HisTrap in SEC, njihovo prisotnost in čistost pa potrdili s prenosom western. Afiniteto spojin (novobiocina in UL-Hsp90-1) do mutant Hsp90β smo ovrednotili z metodo termoforeze na mikroskali. Pri testiranjih mutant z novobiocinom smo potrdili afiniteto vezave v podobnem velikostnem razredu kot pri nemutiranem rekombinantnem Hsp90β, kar nakazuje, da mutaciji bistveno ne vplivata na vezavo novobiocina, oziroma da ostanek glutaminske kisline na 489. mestu ni ključen za interakcijo. V celotnem koncentracijskem območju spojine UL-Hsp90-1 pri nobeni od mutant nismo zaznali vezave na Hsp90β, zato predvidevamo, da ima spojina UL-Hsp90-1 drugačno vezavno mesto na Hsp90β kot novobiocin. Dokončna potrditev bi bila možna šele z določitvijo ko-kristalne strukture.20252025-11-26 12:33:44Magistrsko delo/naloga176283VisID: 122110COBISS_ID: 258919427sl