Karakterizacija proteina WrbA ter homolognih proteinov Ffp1 in Ffp2Glavnik, Hana (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) antibiotikiodpornostWrbAhidroksinaftojska kislinaDo danes je bilo razvitih in odkritih mnogo različnih antibiotikov, vendar je pretirana uporaba le teh, tako v medicini kot v industriji, prispevala k razvoju bakterijske odpornosti. Ena izmed najbolj obetavnih strategij za iskanje novih protimikrobnih učinkovin temelji na majhnih molekulah, ki bi zavirale delovanje specifičnih bakterijskih tarč. Takšne molekule so na primer derivati hidroksinaftojske kisline, ki so se v preteklih raziskavah izkazali kot zelo perspektivne male molekule za zaviranje rasti grampozitivnih bakterij, kot je Staphylococcus aureus. Ti derivati se vežejo tudi na encim WrbA, ki izvira iz bakterije Escherichia coli in vplivajo na njegovo aktivnost. Cilj magistrske naloge je bil podrobneje okarakterizirati vpliv izbranih derivatov hidroksinaftojske kisline na encim WrbA in homologna encima Ffp1 in Ffp2, ki izhajata iz Staphylococcus aureus. V prvem delu smo za vse tri encime določili Michaelisove konstante za substrat NADH in kalijev fericianid. Ker smo v literaturi našli podatek, da lahko ti encimi kot substrat uporabljajo tudi NADPH, smo se tudi zanj odločili določiti Michaelisove konstante. Iz primerjav dobljenih konstant za encim WrbA (Km, NADH z vrednostjo (135 ± 23) µM, Km, NADPH z vrednostjo (483 ± 109) µM) smo dokazali, da imajo vsi trije encimi do NADPH veliko nižjo afiniteto kot do NADH. V nadaljevanju smo določili pH profile encimov in ugotovili, da imata WrbA in Ffp1 optimalno aktivnost pri pH 5,0, medtem ko je Ffp2 optimalno aktiven v širšem območju pH med 6,0 in 8,0. Z masno fotometrijo smo pokazali, da sta v raztopini pri WrbA in Ffp1 v ravnotežju homodimerni in homotetramerni obliki, medtem ko Ffp2 v raztopini tvori le homodimere. V osrednjem delu naloge smo testirali inhibitorni učinek petih derivatov hidroksinaftojske kisline. Med vsemi derivati je 2-hidroksi-1-naftojska kislina imela najmočnejši inhibitorni vpliv na encime, in sicer so bile konstante inhibicije sledeče: EC$_{50, WrbA}$ je enaka (4,4 ± 2,7) µM, EC$_{50, Ffp1}$ je enaka (5,0 ± 0,6) µM, EC$_{50, Ffp2}$ pa je enaka (6,1 ± 0,3) µM. Posebej izrazita je bila občutljivost encima Ffp1 na vse testirane spojine. Na osnovi rezultatov smo 2-hidroksi-1-naftojsko kislino ovrednotili kot najperspektivnejšo spojino za nadaljnji razvoj. Na koncu smo izvedli še HPLC analizo 1 hidroksi-2-naftojske kisline, s katero smo pokazali, da ta v prisotnosti NaClO in p benzokinona razpade, kar je pomembna informacija za razumevanje tako njene uporabnosti kot tudi uporabnosti ostalih derivatov v bioloških sistemih. Pridobljeni rezultati predstavljajo izhodišče za nadaljnje raziskave malih molekul, ki bi lahko delovale kot nove protimikrobne učinkovine.20252025-11-07 11:55:02Magistrsko delo/naloga175780VisID: 25494COBISS_ID: 259186435sl