Ovrednotenje fosforilacije RNA-vezavnih proteinov v nevrosferoidihMatić, Iva (Avtor) Motaln, Helena (Mentor) Rogelj, Boris (Komentor) FUSTDP-43fosforilacijanevrosferoidiSH-SY5YimunocitokemijaFUS in TDP-43 sta RNA-vezavna proteina, vključena v številne celične procese, katerih motnje so povezane z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot sta amiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD). Posttranslacijske modifikacije, zlasti fosforilacija, vplivajo na njuno celično lokalizacijo in funkcijo. V magistrski nalogi smo uporabili tridimenzionalni model nevrosferoidov, ki vsebujejo nevronom podobne celice, diferencirane v petih tednih iz mišjih induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC). Nevrosferoide smo analizirali v štirih časovnih točkah diferenciacije (2., 3., 4. in 5. teden), s pripravo zamrznjenih rezin in imunocitokemijskim označevanjem s protitelesi proti FUS in TDP-43 ter njunim fosforiliranim oblikam (FUS$^{p-Y526}$, TDP-43$^{p-S369}$, TDP-43$^{p-S375}$, TDP-43$^{p-S409/410}$). Za dodatno validacijo rezultatov smo uporabili dvodimenzionalni model diferencirane človeške nevroblastomske celične kulture SH-SY5Y, kjer smo spremljali izražanje izbranih proteinov med 7-dnevno diferenciacijo. Analiza izražanja in celične lokalizacije omenjenih proteinov je bila izvedena s pomočjo konfokalne fluorescenčne mikroskopije. Rezultati so pokazali, da se lokalizacija proteinov FUS in TDP-43 ter njunih fosforiliranih oblik spreminja med diferenciacijo, pri čemer je fosforilacija FUS na Tyr526 povezana z zgodnjimi fazami diferenciacije in prisotnostjo proteina v citoplazmi nevronskih celic. Kolokalizacija FUS$^{p-Y526}$ s kinazami iz družine Src, zlasti s p-Abl, potrjuje njihovo vlogo pri fosforilaciji FUS. V nevrosferoidnem modelu smo z L-glutamatom kot induktorjem kinaz družine Src analizirali njegov vpliv na fosforilacijo FUS ter možen posreden vpliv na fosforilacijo in lokalizacijo TDP-43, pri čemer smo potrdili učinek na oba proteina. Za potrditev diferenciacije celic v specifične nevronske in glialne podtipe smo uporabili protein TUBB3 kot označevalec za nevrone ter protein GFAP kot označevalec za astrocite. Skupno ti rezultati prispevajo k boljšemu razumevanju dinamike lokalizacije fosforiliranih oblik FUS in TDP-43 med diferenciacijo živčnih celic ter potrjujejo uporabnost izbranih celičnih modelov za preučevanje molekularnih mehanizmov, povezanih z nevrodegenerativnimi boleznimi.20252025-10-09 10:55:00Magistrsko delo/naloga174745VisID: 25325COBISS_ID: 258983683sl