Optimizacija izolacije protoplastov vinske trte in genska transformacija z metodo CRISPR/Cas9Perko, Nika (Avtor) Pompe Novak, Maruša (Mentor) protoplastitransfekcijagojenjevinska trtaRastlinski protoplasti se pogosto uporabljajo za transfekcijo in so bili uporabljeni pri različnih rastlinskih vrstah za funkcionalno karakterizacijo genov ter preučevanje signalnih poti. Opisani sistemi za uporabo protoplastov pri vinski trti (Vitis vinifera L.) so še vedno redki, kar je predvsem posledica zahtevnosti izolacije živih protoplastov, njihove transfekcije ter nadaljnjega gojenja v in vitro pogojih. Namen magistrske naloge je bil optimizirati izolacijo, gojenje in transfekcijo protoplastov iz tkivne kulture vinske trte sorte Zweigelt ter s tem prispevati k razvoju metod za povečanje odpornosti vinske trte na fitoplazme. Pri encimski izolaciji protoplastov smo opazovali vpliv homogenizacije listov, starosti listov, starosti tkivne kulture, sestave encimske raztopine in časa encimske razgradnje. Opažen je bil trend boljše izolacije iz prvih odprtih listov, razrezanih na 3 mm široke trakove, iz mlajših tkivnih kultur, s peturno encimsko razgradnjo z raztopino Z, katere sestava je povzeta po Zhao in sod. Za namen optimizacije pogojev za gojenje protoplastov smo pri nekaterih vzorcih vključili tudi stresanje. Ugotovili smo, da stresanje zmanjša preživetje, medtem ko so v mirovanju ostali živi do tri dni. Transfekcijo protoplastov smo izvedli ob prisotnosti PEG in plazmida. Uspešnost transfekcije smo potrdili s plazmidom, ki je nosil zapis za protein eGFP, čigar fluorescenco smo zaznali pod konfokalnim mikroskopom. Z reakcijo LR, ki omogoča mestno-specifično rekombinacijo med mestoma attL in attR, smo sestavili plazmid, ki je vseboval zapise za protein Cas9, usmerjevalno RNA in del gena vvCWINV1B. Namen zasnove je bila tarčna inaktivacija gena vvCWINV1B, katerega izražanje se, glede na rezultate predhodnih študij, poveča ob okužbi rastline s fitoplazmo. Uporaba tako transformirane rastline bi omogočila funkcijsko analizo vloge gena ob okužbi. Za transfekcijo smo uporabili protoplaste iz embriogenega kalusa vinske trte sorte Zweigelt. Reakcijo smo izvedli iz 1,5 × 10$^5$ protoplastov in 10 μg plazmida ter jo prekinili po 5 minutah. Uspešnost transfekcije smo želeli preveriti s Sangerjevim sekvenciranjem, vendar smo pri tem naleteli na težave s pomnoževanjem dela genomske DNA. Rezultati naših poskusov so razkrili trende, ki predstavljajo izhodišča za nadaljnje optimizacijske raziskave. Na podlagi teh ugotovitev bi bilo smiselno v prihodnje usmeriti več eksperimentalnega dela v izboljšanje postopkov za izolacijo in gojenje protoplastov iz listnega tkiva vinske trte sorte Zweigelt.20252025-09-30 15:10:01Magistrsko delo/naloga174283VisID: 25316COBISS_ID: 258917635sl