Načrtovanje in priprava de novo vezavnega proteina za MLKLBedrač, Nika (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) LC/MSMLKLproteinske interakcijeRFdiffusionSECtricinski gelNekroptoza je oblika programirane celične smrti, pri kateri imajo ključno vlogo specifične signalne poti in proteini, kot so RIPK1, RIPK2 in MLKL. Nastopi kot posledica stimulacije receptorjev smrti, Tollu podobnih receptorjev ali preko delovanja interferonov. Gre za kontroliran proces, pri katerem pride do povečanja volumna celice, nabrekanja organelov, izgube integritete celične membrane in sproščanja celične vsebine v okolico. Ključni posrednik signalnega odziva pri nekroptozi je protein MLKL (angl. mixed-lineage kinase domain-like), ki ga sestavljata psevdokinazna domena in domena svežnja štirih vijačnic (4HB). Raziskave so pokazale, da domena 4HB omogoča oligomerizacijo in translokacijo proteina MLKL na celično membrano, kjer ta povzroči njeno permeabilizacijo.V okviru magistrske naloge smo preko de novo načrtovanja proteinov, izvedenega z uporabo programa RFdiffusion, pripravili krajši protein. Namen eksperimentalnega dela je bil preveriti, ali se vezavni protein, zasnovan z bioinformatskimi orodji, v laboratorijskih pogojih izraža in veže na tarčni protein MLKLN-154. Za to smo izolirali in očistili tako tarčni protein MLKLN-154 kot tudi de novo vezavni protein GGNB-MLKL-BIND-015 ter analizirali njuno morebitno interakcijo. Izražanje obeh proteinov smo izvedli v bakterijskih celicah, ključen korak čiščenja v obeh primerih pa je bila afinitetna kromatografija (IMAC in ponovni IMAC). Njuno potencialno interakcijo smo preverili z velikostno izključitveno kromatografijo (SEC), vendar rezultati niso pokazali medsebojne interakcije. Ker je molekulska masa vezavnega proteina le 2,4 kDa, smo za boljšo detekcijo uporabili tudi tricinske NaDS- PAGE gele, ki omogočajo ločevanje majhnih proteinov. Potencialno interakcijo smo dodatno preverili s fluorescenčno (intrinzično) spektroskopijo triptofana, ki temelji na premikih emisijskega spektra ob spremembah okolja okoli triptofanskih ostankov. Dobljeni rezultati nudijo vpogled v zmožnosti de novo načrtovanja vezavnih proteinov s sodobnimi bioinformatskimi orodji in njihovo implementacijo v eksperimentalno delo. Magistrska naloga predstavlja temelj za nadaljnje raziskave na področju bioinformatike in prenos teoretičnih modelov v prakso, obenem pa poudarja uporabo različnih analiznih tehnik, kot je fluorescenčna spektroskopija triptofana, ki ponuja drugačen vpogled v interakcije med proteini na molekulski ravni.20252025-09-24 15:05:02Magistrsko delo/naloga173875VisID: 25372COBISS_ID: 257996035sl