Proteinski inženiring oligomernih encimov z motivom ovitih vijačnic za razgradnjo polietilen tereftalataPerko, Zala (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) Kobe, Boštjan (Komentor) polietilen tereftalatbiorazgradnjaPET-hidrolazaoligomerizacijaovite vijačniceKoličina plastičnih odpadkov iz leta v leto eksponentno narašča. V letu 2023 smo na svetu proizvedli več kot 410 milijonov ton plastike, od katerih je nad 90 % temeljilo na fosilnih gorivih. Pri iskanju novih metod recikliranja odpadne plastike so znanstveniki odkrili mikroorganizme, ki v svojo okolico izločajo encime in izkoriščajo produkte razgradnje plastičnih polimerov kot vir energije. Polietilen tereftalat (PET) je polimer tereftalne kisline in etilenglikola, povezanih s hidrolizabilno estrsko vezjo, ki jo lahko cepijo PET-hidrolaze. Predpogoj za razgradnjo je adsorpcija encimov na površino hidrofobnega polimernega substrata. V okviru magistrskega dela smo poskušali pripraviti fuzijske in himerne oligomere CaPETazeM9 iz bakterije Cryptosporangium aurantiacum, TurboPETaze iz bakterije HR29 in BHETaze BsEstΔ5 iz bakterije Bacillus subtilis. BsEstΔ5 razgrajuje intermediata hidrolize PET in s tem preprečuje inhibicijo PET-hidrolaz. Da bi dosegli oligomerizacijo, smo monomerne encime pripravili v fuziji z domeno paralelne ovite vijačnice proteina GCN4 iz mezofilne kvasovke Saccharomyces cerevisiae ter antiparalelne ovite vijačnice proteina Sso10a1 iz hipertermofilne arheje Sulfolobus solfataricus. Naš cilj je bil ugotoviti, ali fuzijske in himerne različice encimov dimerizirajo in ali s tem izboljšamo adsorpcijo na plastični substrat ter posledično aktivnost. Oligomerizacijo smo analizirali s kromatografijo z ločevanjem po velikosti in masno fotometrijo, aktivnost pa smo detektirali z določanjem koncentracije produktov razgradnje filma PET in encimskim testom na malomolekulski substrat p-nitrofenil butirat (pNPB). Ugotovili smo, da C-končne fuzije z domeno ovite vijačnice proteina GCN4 poleg dimerov tvorijo tudi višja oligomerna stanja, ne glede na dolžino povezovalnega zaporedja med encimom in domeno ovite vijačnice. V testiranih pogojih ohranijo aktivnost na pNPB, zniža pa se jim aktivnost na polimerni substrat PET. Zaradi težav z izražanjem in stabilnostjo konstruktov s TurboPETazo in domeno ovite vijačnice proteina Sso10a1 v testiranem koncentracijskem območju nismo zaznali tvorbe dimera pri fuzijskem proteinu in pri himeri, kar bi lahko bil razlog za ohranitev višje ravni encimske aktivnosti tako na pNPB, kot tudi na PET. Z meritvami dinamičnega sipanja svetlobe smo potrdili, da uvedba fuzije z domeno ovite vijačnic ne vpliva na termično stabilnost preučevanih encimov.20252025-09-16 07:40:01Magistrsko delo/naloga173318VisID: 25499COBISS_ID: 257762307sl