Analiza različic proteinov v procesu popravljanja neujemanja DNA z dvohibridnim sistemom kvasovkeKojić, Lia (Avtor) Petrovič, Uroš (Mentor) Čremožnik Zupančič, Jerneja (Komentor) Lynchev sindromMLH1PMS2Y2HLynchev sindrom je avtosomno dominantno dedovan sindrom, pri katerem imajo bolniki predispozicijo za razvoj rakavih obolenj. Okvarjeni so namreč geni, ki sodelujejo v procesu popravljanja neujemanja DNA (MMR). Med najpogosteje okvarjenimi je gen MLH1. Mutacije v tem genu pogosto vodijo v nezmožnost interakcije s proteinom PMS2, zato je beleženje patogenih različic genov za MMR ključno za diagnosticiranje Lynchevega sindroma. Ena od glavnih in vivo metod za preučevanje interakcij protein-protein je dvohibridni sistem kvasovke (Y2H), ki je hkrati osrednja metoda našega magistrskega dela. Y2H deluje na principu spojitve preiskovanih proteinov z domenama transkripcijskega faktorja, sklenitev katerih, v primeru interakcije preiskovanih proteinov, aktivira poročevalski sistem. Cilj naloge je bil pripraviti knjižnico alelov za protein MLH1, ki bi potencialno lahko vodile v razvoj Lynchevega sindroma. V primeru, da z Y2H pokažemo interakcijo med preiskovanima proteinoma, mutacija najverjetneje ni patogena. V ta namen smo z metodo PCR pomnožili pet fragmentov, ki so skupaj nosili zapis za šest degeneriranih kodonov. Ustvarjeno knjižnico naključnih različic smo vnesli v celice kvasovke Saccharomyces cerevisiae. Uspešnost sestavljanja knjižnice smo preverili s sekvenciranjem po Sangerju. Ugotovili smo, da je in vitro združevanje fragmentov z metodo PCR bolj učinkovito kot njihovo sestavljanje in vivo z rekombinacijskim sistemom kvasovke. Metodo Y2H smo nato izvedli v večjem volumnu in pomnožene variabilne dele v zaporedju plazmidov sekvencirali z metodo sekvenciranja amplikonov. Z bioinformatsko analizo rezultatov smo pokazali učinkovitost selektivnih gojišč za Y2H, vendar relativno nizko pokritost knjižnice v primerjavi s teoretično velikostjo. Ugotovili smo, da ja večina patogenih mutacij na mestih kodonov 636 in 661, ki se nahajata bolj proti notranjosti proteina MLH1.[L. Kojić]20252025-09-14 07:16:30Magistrsko delo/naloga173215UDK: 579.61:616-006(043.2)VisID: 264311COBISS_ID: 248876547sl