Razvoj amplikonov za sekvenciranje celotnega genoma ortohantavirusa Dobrava v SlovenijiRak, Karin (Avtor) Korva, Miša (Mentor) amplikoniortohantavirus Dobravasekvenciranje genomasekvenciranje naslednje generacijeNaravni gostitelji ortohantavirusov so glodavci (Rodentia), rovke (Soricidae) in netopirji (Chiroptera). Ortohantavirusi, ki povzročajo bolezni pri ljudeh, se v naravi ohranjajo v glodavcih in rovkah. V diplomski nalogi smo se osredotočili na vrsto Orthohantavirus dobravaense (virus Dobrava; DOBV), ki je bil odkrit v Sloveniji v rumenogrli miši (Apodemus flavicollis), ki pri ljudeh povzroči hemoragično mrzlico z renalnim sindromom [1]. V diplomskem delu smo načrtali začetne oligonukleotide, s katerimi smo določili celoten genom za človeka patogenega DOBV. Delali smo z virusno RNA, izolirano iz celične kulture virusa Vero E6 in iz tkiva okužene rumenogrle miši. Ortohantavirusi imajo segmentiran genom (segmenti S, M in L), zato smo razvili 3 amplikonske sheme, za vsak segment posebej. Za določitev amplikonov smo poravnali vsa do sedaj znana zaporedja DOBV in identificirali ohranjene regije ter s programskim orodjem PrimalScheme in VarVamp načrtali začetne oligonukleotide. Te smo preverili tako, da smo iz izolirane RNA z reverzno transkripcijo sintetizirali cDNA ter jo pomnožili z izbranimi začetnimi oligonukleotidi. Amplikone smo preverili z gelsko elektroforezo in sekvencirali na platformi Oxford Nanopore. Delo je zajemalo tudi analizo z bioinformacijskimi orodji. Rezultati diplomske naloge vključujejo načrtovanje začetnih oligonukleotidov, celovito analizo PCR-produktov na agaroznem gelu, določitev nukleotidnega zaporedja vzorcev, pridobljenih z različnimi metodami ter podrobno analizo prileganja sekvenčnih odčitkov in konsenznih zaporedij genoma DOBV. S prvimi amplikonskimi shemami smo uspešno načrtali začetne oligonukleotide za segmenta L in S. Za segment M smo pripravili novo shemo, ki pa še ni dosegla optimalne učinkovitosti, zato je cilj nadaljnjih raziskav njena izboljšava. Validacija metode na tkivnem vzorcu miši je potrdila zanesljivost in učinkovitost razvite metode. Poleg tega je uporaba metode SISPA-A jasno pokazala, zakaj je za natančno določitev virusnega genoma ključno skrbno načrtovanje amplikonskih shem. Na koncu smo pridobili skupna zaporedja vseh treh segmentov genoma DOBV, kar predstavlja pomemben korak v nadaljnjem raziskovanju genetske raznolikosti ortohantavirusov.20252025-09-10 16:05:01Diplomsko delo/naloga172685VisID: 25687COBISS_ID: 257621507sl