Vpliv aktivnosti Na$^+$/K$^+$ črpalke na tvorbo laktata v skeletnomišičnih celicah v razmerah in vitroŠenica Pavletič, Primož (Avtor) Pirkmajer, Sergej (Mentor) Na⁺/K⁺-ATPazaECAROCRMCTL6Skeletnomišične celice energije za svoje delovanje pridobivajo prek mitohondrijske oksidativne fosforilacije in glikolize. Laktat je glavni produkt glikolize in hkrati potencialni vir energije. V diplomski nalogi smo na podganjih mišičnih celicah linije L6 preučevali, katera presnovna pot prevladuje pri sintezi ATP. Prav tako nas je zanimalo, ali povečana aktivnost Na$^+$/K$^+$-ATPaze, ene največjih porabnic ATP, sproži preklop v smer glikolize in poveča nastajanje laktata. Za določitev presnovnega fenotipa celic L6 smo analizirali izraženost laktatnih prenašalcev MCT1, MCT2 in MCT4 ter z napravo Seahorse Agilent testirali, kateri inhibitor MCT-prenašalcev je najučinkovitejši. S pomočjo naprave smo tudi kvantificirali delež proizvedenega ATP prek oksidativne fosforilacije in glikolize. Seahorse Agilent smo uporabili ob dodatku specifičnih presnovnih zaviralcev (2-DG, GNE-140, MON, OM) ter zaviralca MCT1 (AZD) in s tem preučevali energetskega metabolizma celic (meritve ECAR in OCR). Z monenzinom smo stimulirali Na$^+$/K$^+$-ATPazo, da bi posnemali povečano porabo ATP. Ekspresijski profil laktatnih prenašalcev (prevladujoč MCT1, nizka raven MCT4 in zanemarljivo nizka raven MCT2) kaže na oksidativen presnovni fenotip celic L6, kar pokažejo tudi rezultati analize Seahorse – v teh celicah večina ATP nastaja prek oksidativne fosforilacije. LDH test je pokazal, da GNE-140 že v nizkih koncentracijah učinkovito zavira pretvorbo piruvata v laktat, učinkoviteje kot OXA. To smo dodatno potrdili tudi z uporabo naprave Seahorse Agilent. Zaviranje glikolize z 2-DG, zaviranje LDH z GNE-140 in zaviranje prenosa laktata z zaviralcem MCT1 (AZD) je povzročilo izrazit padec ECAR, medtem ko je OCR ostal skoraj nespremenjen. Po dodatku MON se je ECAR izrazito povišal le ob prisotnosti AZD. Pri 2-DG in GNE-140 je bilo povišanje le rahlo, kar nakazuje, da glikoliza pomembno prispeva k zagotavljanju ATP za delovanje Na$^+$/K$^+$-ATPaze. Zaviranje oksidativne fosforilacije z OM je močno zmanjšalo OCR, medtem ko je aktivacija Na$^+$/K$^+$-ATPaze z MON povečala ECAR. Iz tega sklepamo, da se celice L6 ob povečani potrebi po energiji preusmerijo na glikolizo, kadar oksidativna pot ne zadošča. To odraža njihovo presnovno prilagodljivost.20252025-09-05 12:30:01Diplomsko delo/naloga172087VisID: 25309COBISS_ID: 254700803sl