Detekcija interakcij proteinov TTF2, PRPF40A in CRACD z matrinom 3 s protitelesiČarman, Jasna (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) ALSmatrin 3TTF2PRPF40ACRACDAmiotrofična lateralna skleroza je hitro napredujoča nevrodegenerativna bolezen motoričnega živčevja, za katero je značilna mišična atrofija in postopen upad motoričnih funkcij. Učinkovitih terapij za upočasnitev napredovanja bolezni še ni, zato večina pacientov umre zaradi odpovedi dihal in zadušitve. Eden od vzrokov za ALS so mutacije v genih za RNA-vezavne proteine, kot je jedrni protein matrin 3. Ta se pri ALS kopiči v jedru, pri čemer pride do nepravilnosti v organizaciji kromatina, transkripciji in izrezovanju intronov, ali pa agregira v citoplazmi in poruši transport in stabilnost RNA. Ena od točkovnih mutacij tega proteina, povezana z ALS, je S85C. Interakcije matrina 3 in njegovih mutantov z drugimi proteini so slabo opisane. Zato smo v okviru diplomskega dela želeli potrditi interakcije matrina 3 in njegovega mutanta S85C s proteini TTF2, PRPF40A in CRACD. Uporabili smo vzorce lizatov celic HEK 293 TR-Flp-In, pripravljene z metodo BioID. Pri tej metodi preiskovani matrin 3 pripravimo v fuziji z biotin ligazo BioID2, ki ob dodatku biotina biotinilira proteine v bližini, ki so potencialni interaktorji preiskovanega proteina. Nato biotinilirane proteine izoliramo s tehniko "pull down". Predhodno so potencialne interaktorje določili z masno spektroskopijo, mi pa smo jih želeli potrditi s prenosom western. Uspešno smo kot inetraktor detektirali protein TTF2, ki ga je bilo nekoliko več v vzorcu interaktorjev matrina 3 z mutacijo S85C. Proteinov PRPF40A in CRACD pa smo v vzorcih z matrinom 3 detektirali manj kot v vzorcu lizata neinduciranih celic, zato interakcij matrina 3 s PRPF40A in s CRACD nismo potrdili. Poleg tega smo analizirali kolokalizacijo matrina 3 in proteina TTF2 z imunocitokemijsko tehniko. Ugotovili smo, da je protein TTF2 pretežno prisoten v citoplazmi, medtem ko smo matrin 3, ki je sicer jedrni protein, detektirali tako v jedru kot v citoplazmi. V nekaterih primerih smo opazili kolokalizacijo obeh proteinov, vendar matrina 3, ki je endogeni protein, nismo detektirali v vseh celicah, zato bi morali poskuse ponoviti in optimizirati.20252025-09-03 14:50:01Diplomsko delo/naloga171862VisID: 25573COBISS_ID: 253408771sl