Vloga P-telesc pri razgradnji mRNA uravnavani s proteinom Lin28A.Starman, Maša (Avtor) Modic, Miha (Mentor) LIN28AP-telescaRNA-vezavni proteiniposttranskripcijska regulacijakoimunoprecipitacijaDDX6mišje embrionalne matične celiceBrezmembranski celični kondenzati, kot so P-telesca, predstavljajo pomemben mehanizem prostorske organizacije znotraj celice, ki omogoča natančno regulacijo izražanja genov na posttranskripcijski ravni, vendar njihova funkcionalna povezava s ključnimi regulatorji celične usode, kot je LIN28A, ostaja premalo raziskana. V magistrskem delu smo proučevali vlogo citoplazemskih procesitnih telesc pri LIN28A-posredovanem uravnavanju stabilnosti mRNA v mišjih zarodnih matičnih celicah. Ker smo želeli določiti interakcijske partnerje LIN28A, smo razvili in optimizirali protokol za ko-imunoprecipitacijo, ki je omogočil učinkovito izolacijo specifičnih interakcij. Ugotovili smo, da pufer z 0,1–1 % Tween 20 in fiziološko koncentracijo soli omogoča stabilno zajetje nativnih kompleksov z minimalnim nespecifičnim ozadjem, pri čemer ena ura inkubacije zadošča za zadosten izplen. Dodatno smo optimizirali postopno mehko elucijo z natrijevim citratom, ki ohranja proteinske komplekse v nativni obliki in je primerna za nadaljnjo proteomsko analizo. Z vključitvijo benzonaze smo pokazali, da večina interakcij ni RNA-odvisna; v nekaterih primerih je razgradnja RNA celo omogočila vezavo dodatnih proteinov, kar nakazuje na možen zaviralni vpliv RNA na dostopnost vezavnih mest. Z uporabo tehnologije CRISPR/Cas9 smo z izbrisom gena DDX6 onemogočili tvorbo P-telesc ter nato uvedli inducibilno izražanje proteina LIN28A-GFP. Kvantitativna imunofluorescenčna analiza je potrdila, da se LIN28A kopiči v P-telescih le, če so ta funkcionalno prisotna, kar kaže, da je za relokalizacijo ob diferenciacijskih signalih nujna njihova struktura. Nazadnje smo z imunodetekcijo pokazali, da so P-telesca potrebna za stabilizacijo SOX2, kar neposredno potrjuje, da P-telesca niso le mesta razgradnje RNA, temveč prostorsko organizirana regulatorna središča, nujna za zaščito in stabilizacijo mRNA s pomočjo LIN28A. Rezultati naše raziskave prvič eksperimentalno potrjujejo neposredno vlogo P-telesc pri stabilizaciji specifičnih molekul RNA prek delovanja LIN28A, kar predstavlja pomemben dokaz njihove funkcionalnosti v uravnavanju celične usode. To je ključen prispevek k razumevanju, kako celica prostorsko organizira posttranskripcijsko regulacijo, in hkrati odpira nove možnosti za razvoj terapevtskih pristopov, zlasti na področju regenerativne medicine, diferenciacije in bolezni, povezanih z motnjami v stabilnosti mRNA. Na tej osnovi bodo prihodnje raziskave lahko še natančneje opredelile mehanizme delovanja P-telesc in raziskale njihovo vlogo v različnih fizioloških in patoloških kontekstih.20252025-07-20 07:15:12Magistrsko delo/naloga170883VisID: 257864COBISS_ID: 243371523sl