Analiza učinkovitosti razcepljenih baznih preurejevalcev povezanih z ovitimi vijačnicami v človeški celični liniji HEK293Javornik, Anja (Avtor) Lainšček, Duško (Mentor) CRISPRpreurejanje genomarazcepljeni bazni preurejevalciovite vijačniceBazni preurejevalci so biotehnološko orodje za preurejanje genoma in omogočajo natančno spreminjanje baznih parov na tarčnem zaporedju brez ustvarjanja dvojnoverižnih prelomov v DNA. Citozinski (CBE) oziroma adeninski bazni preurejevalci (ABE) so sestavljeni iz fuzije nikaze Cas9 (nCas9) ter citozinske ali adeninske deaminaze. V magistrskem delu predstavljamo sistem baznega preurejanja, ki temelji na razcepljenih baznih preurejevalcih (ccBE). nCas9 in deaminaza sta v tem primeru nekovalentno povezana preko dveh peptidov, ki tvorita ovito vijačnico. V človeško celično linijo HEK293 smo s transfekcijo vnesli plazmide z zapisom za izražanje ccCBE ali osnovnega fuzijskega baznega preurejevalca TadCBEa ter ugotovili, da se njihova učinkovitost na nobenem lokusu ne razlikuje. S titracijo plazmidov z geni za nCas9 in deaminazno podenoto razcepljenega adeninskega baznega preurejevalca smo na poročevalski celični liniji na osnovi HEK293 določili optimalno razmerje plazmidov za nCas9 in deaminazno podenoto 20:1. Na štirih izbranih genomskih lokusih smo primerjali delovanje ccCBE pri razmerjih deaminaze in nCas9 1:1 in 1:20. Pokazali smo, da je pri obeh razmerjih učinkovitost preurejanja tarčne baze ter preurejanja sosednjih netarčnih baz primerljiva. Čeprav izbrano razmerje ni pokazalo večje učinkovitosti pri preurejanju tarčne baze s ccCBE v primerjavi s TadCBE, smo ugotovili, da je sistem enako aktiven, če uporabimo 20-krat nižjo koncentracijo plazmida z deaminazo, kot plazmida z nCas9. Na koncu smo za vse na novo pripravljene preurejevalce določili še okno preurejanja in ugotovili, da imajo najvišjo učinkovitost preurejanja med položaji od tri do sedem baz od začetka sekvence tarčnega zaporedja (5' do 3'). Razliko med preurejevalci smo opazili pri ccCBE 1:1, ki ima na položaju šest in sedem manjše delovanje v primerjavi s ccCBE 20:1 in fuzijskim CBE.20252025-07-06 07:16:05Magistrsko delo/naloga170446VisID: 257738COBISS_ID: 241816835sl