Priprava celičnega sinteznobiološkega sistema za zaznavo vankomicina v bakteriji Escherichia coliDajčman, Rebeka (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) VanRSbiosenzorvankomicinE. coliSinteznobiološki senzor je naprava, ki izkorišča biološke elemente ter jih sestavlja v biološka vezja, ki ustvarjajo merljiv signal ob prisotnosti tarčnega signala iz okolja. Prisotnost antibiotika vankomicina v naravi lahko pripelje do razvoja odpornosti proti temu antibiotiku, zato je okoljski monitoring ključnega pomena za preprečevanja tega pojava. Dvokomponentni sistem VanRS je regulatorni sistem pri na vankomicin odpornih bakterijah, ki v okolju prepozna signal vankomicin z receptorsko histidin kinazo VanS. Ta aktivira transkripcijski regulator VanR, ki rekrutira RNA-polimerazo na tarčni promotor ter s tem sproži transkripcijo genov za odpornost proti vankomicinu. V odsotnosti signala deluje receptor VanS kot fosfataza. V magistrskem delu smo želeli dvokomponentni sistem, ki ga najdemo pri po Gramu pozitivnih bakterijah, prenesti v po Gramu negativno bakterijo E. coli. Ker vankomicin praviloma ne prehaja skozi zunanjo membrano te bakterije, smo za šasijo izbrali poseben sev E. coli GKCW104, ki v prisotnosti arabinoze tvori pore na zunanji membrani ter tako omogoči vankomicinu vstop v periplazmo. S testom viabilnosti smo določili maksimalno koncentracijo vankomicina v gojišču 0,1 μg/mL, ki ne vpliva na preživetje izbranih celic v razponu osmih ur. Po priporočilih sinteznobiološkega standarda RFC 10 smo pripravili vektor z zapisom za zeleni fluorescenčni protein pod inducibilnim promotorjem PvanY. Zapisa za VanRm in VanS smo pridobili iz bakterije Enterococcus faecalis z verižno reakcijo s polimerazo in ju nato pod konstitutivnim promotorjem vstavili v biološko vezje, ki je že vsebovalo reporterski del. Z vektorjem, ki je nosil komponente biosenzorskega vezja, smo uspešno transformirali bakterijo E. coli GKCW104. Nato smo na njej določili koncentracijsko odvisnost signala ter preverili pojav nespecifične fluorescence s kontrolami.Pojav nespecifične fluorescence, ki ni bil odvisen od prisotnosti vankomicina, smo opazili pri vzorcih z nepopolnim biosenzorskim vezjem. Intenziteta je bila celo višja kot v vzorcih s popolnim vezjem. Pri preučevanju odziva biosenzorskih celic s popolnim vezjem na različne koncentracije vankomicina, intenzitete fluorescence niso naraščale s koncentracijo vankomicina, iz česar smo zaključili, da pripravljeni biosenzor ni zmožen reagirati na vankomicin v izbranem koncentracijskem območju.20252025-07-02 13:31:40Magistrsko delo/naloga170155VisID: 22917COBISS_ID: 243049731sl