Načrtovani proteini iz svežnjev vijačnic kot označevalci za krio-elektronsko mikroskopijoVidmar, Sara (Avtor) Gradišar, znan. sod. dr. Helena (Mentor) Jerala, Roman (Komentor) obvite vijačnicekrio-elektronska mikroskopijaproteinski origaminačrtovani proteiniV doktorski nalogi smo želeli raziskati uporabnost sintetičnih proteinskih nanostruktur z namenom uporabe pri krio-elektronski mikroskopiji. V delu smo obravnavali proteinske bionanostrukture, ki tvorijo stabilne, natančno načrtovane konformacije. Poglavitni cilj je bil zasnovati in sintetizirati de novo proteinske označevalce, ki bi, vezani na tarčne strukture, zaradi svojevrstne oblike izboljšali prepoznavanje le-teh. Uporabili smo t.i. proteinski origami, ki temelji na obvitih vijačnicah ki se samosestavljajo v načrtovane poliedrske strukture. Nabor gradnikov dimernih obvitih vijačnic smo razširili še na svežnje treh ali štirih vijačnic. To nam je omogočilo razširitev nabora možnih topologij struktur, njihovih konformacij in permutacij, ter večjo molekulsko maso in izboljšanje nekaterih lastnosti načrtovanih proteinov. V prvem delu smo se osredotočili na pripravo enostavnejših oblik, t.j. trikotnika in zvezde z različnimi postavitvami gradnikov znotraj polipeptidne verige. Kljub uspešnemu izražanju v bakterisjkih celicah in zvitju v načrtovano strukturo so bili ti proteini premajhni in preveč fleksibilni oz. heterogeni za določanje strukture in uporabo v krio-elektronski mikroskopiji. V drugem delu smo načrtovali tetraedrske strukture, katerih stabilnost in specifična oblika bi lahko omogočili boljšo vizualizacijo tarčnih struktur. Pri karakterizaciji smo uporabili različne metode, ki so pokazale, da se vsi izolirani proteini zvijejo v načrtovano strukturo. Vsem proteinom so bili skupni visoka vsebnost alfa vijačnic, temperaturna stabilnost in dobra sposobnost ponovnega zvijanja. To nam je omogočilo prvo določitev strukture de novo načrtovanega tetraedrskega proteina s krio-elektronsko mikroskopijo. Raziskavo smo razširili na uporabo dveh svežnjev v eni strukturi in na samosestavljanje iste strukture iz dveh enakih, krajših polipeptidnih verig. S tem smo pokazali veliko fleksibilnost in možnost za nadzor pri samosestavljanju takšnih struktur. V doktorskem delu smo pokazali, da je mogoče načrtovati modularne proteine s točno določeno obliko, ki se stabilno zvijejo v načrtovane strukture, dodatna uvedba svežnjev vijačnic pa pripomore k strukturni raznolikosti in stabilnosti. Na podlagi rezultatov menimo, da bi takšne proteine lahko uporabili kot dostavne sisteme, ter za kompartmentalizacijo ali razvoj novih označevalcev za krio-elektronsko mikroskopijo.20252025-06-11 08:15:10Doktorsko delo/naloga169777VisID: 35099sl