Mehanozaznavanje na osnovi INSRTR-jaStrniša, Gregor (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) Taler-Verčič, Ajda (Komentor) mehanozaznavanjeCARalosterijaINSRTRMehanoreceptorji igrajo ključno vlogo v mnogih celičnih procesih, kot je na primer izražanje proteinov, hkrati pa omogočajo celicam, da se odzovejo na spremembe v svoji okolici. Nedavne raziskave so pokazale, da lahko kot mehanoreceptorji delujejo tudi T in B celični receptorji. V okviru magistrske naloge smo načrtovali nov mehanoreceptor, ki smo ga osnovali na proteinu CAR (himerni antigenski receptor) in konstruktu INSRTR ngGFP. Sistem INSRTR temelji na vstavitvi peptida, ki tvori obvito vijačnico v proteinu na način, da slednji ne spremeni delovanja proteina. Dodatek peptida, ki z vstavljenim tvori obvito vijačnico (nastanek dimera), vodi v spremembo strukture in s tem vpliva na funkcijo proteina. Pripravili smo fuzijske proteine tako, da smo v zapis za CAR vstavili zapis za avtoinhibiran fluorescenčni protein ngGFP. Fuzijske proteine smo izražali v celicah HEK293T, uspešnost izražanja pa smo dokazali s prenosom western. Funkcijo umetnega mehanoreceptorja smo preverjali z dodatkom celic Raji k transfeciranim celicam. Celice Raji izražajo antigen CD19, protein, proti kateremu je bil usmerjen scFv našega fuzijskega proteina. Interakcija med receptorjem CAR in antigenom, izraženim na celicah Raji, bi povzročila aktivacijo mehanosenzorja (povišanje fluorescence), kar smo spremljali s konfokalno mikroskopijo. Pred dodatkom celic Raji smo zaznali fluorescenco na membrani celic, transfeciranih z avtoinhibiranimi in konstitutivno aktivnimi konstrukti. Dodatek celic Raji ni imel učinka na spremembo fluorescence iz česar smo sklepali, da mehanosenzor ne deluje pod temi pogoji. Pripravili smo nove konstrukte, kjer smo odstranili variabilni del receptorja. Avtoinhibirane konstrukte smo aktivirali z dodatkom peptida, ki z vstavljenim peptidom tvori obvito vijačnico, ter zaznali fluorescenco, lokalizirano na celični membrani. Preverili smo vpliv različne dolžine povezovalnega zaporedja med vijačnicama. Poleg dolžine povezovalnega zaporedja smo želeli ugotoviti tudi vpliv odstranitve avtoinhibitorne zanke. V ta namen smo v povezovalno zaporedje dodali cepitveno mesto za proteazo TEV. Ob dodatku proteaze TEV k celicam smo opazili spremembo fluorescence. Pripravili smo več različnih fuzijskih proteinov in z njimi dokazali novo možnost uporabe obvitih vijačnic in načina za pripravo novih mehanosenzorjev.20252025-06-04 14:55:04Magistrsko delo/naloga169572VisID: 24127COBISS_ID: 239257603sl