Priprava plazmidov z vključenimi tarčami hsa-miR-20b-5p in njihovo potrjevanje z luciferaznim testom v sesalskih celicahPrezelj, Anja (Avtor) Ostanek, Barbara (Mentor) Vrščaj, Lucija Ana (Komentor) BMPR2FZD3luciferazni testhsa-miR-20b-5posteoporozaMolekule mikro RNA postajajo vedno bolj zanimive za raziskovanje, saj se vpletajo v mnogo fizioloških in patoloških procesov v telesu ter tudi v procese kostne prenove. Porušena kostna prenova vodi v različne bolezni, med drugim tudi v osteoporozo. V predhodnih raziskavah na Katedri za klinično biokemijo so ugotovili spremenjeno izražanje hsa-miR-20b-5p v povezavi z zdravljenjem osteoporoze. Namen naloge je bil poiskati in eksperimentalno potrditi tarčne gene te mikro RNA. Na podlagi bioinformatične analize smo izbrali gena FZD3 in BMPR2. Zasnovali smo oligonukleotide, ki so vsebovali vezavno mesto za hsa-miR-20b-5p na osnovi zaporedij nukleotidov v informacijski RNA tarčnih genov. Poleg tarčnih zaporedij smo zasnovali tudi zaporedje za pozitivno kontrolo, ki je bila komplementarno zaporedje nukleotidov mikro RNA. Sledila je optimizacija procesa vnosa oligonukleotidov v plazmid pmirGLO. Celoten proces je obsegal restrikcijo plazmida, agarozno gelsko elektroforezo, ligacijo oligonukleotidov v razrezan plazmid in transformacijo celic Top10 s tem plazmidom. Pripravljene plazmide smo v procesu transfekcije vnesli v dve sesalski celični liniji (HOS in HeLa). Na teh celicah smo nato izvedli dvojni luciferazni test. Izmerili smo kresničkino in Renilla luciferazno aktivnost. Ti dve vrednosti smo med sabo delili, da smo podatke normalizirali, nato pa smo jih s pomočjo statističnega programa SPSS analizirali. Ugotovili smo, da se je hsa-miR-20b-5p v celični liniji HeLa vezala na zaporedji za FZD3 in BMPR2, s čimer smo potrdili njihovo direktno interakcijo. V celični liniji HOS ni bilo statistično pomembnih razlik med nobenim parom vzorcev, vzrok temu je bila najbrž slabša transfekcija, ki bi jo bilo v prihodnje treba optimizirati. Dokazana vezava hsa-miR-20b-5p na ta dva gena bi lahko bila v prihodnje uporabna osnova za razvoj novih terapevtskih možnosti zdravljenja bolezenskih stanj, kjer je cilj zmanjšanje tvorbe kostnine (npr. kostni rak), po drugi strani bi lahko to vezavo poizkušali zavirati, s čimer bi dobili nove terapevtske možnosti pri zdravljenju osteoporoze.20252025-05-21 08:45:04Magistrsko delo/naloga169258VisID: 114771sl