Dinamika prenosa lokalnih anestetikov skozi membrano nevrona in njihovo antioksidativno delovanjeKavčič, Hana (Avtor) Mavri, Janez (Mentor) lokalni anestetikišibka bazaprehod skozi membranoblokada živčnega signalametode računske kemijemodel difuzijeprosta energija prehodačas do začetka delovanjatrajanje delovanjaantioksidativna aktivnostlovljenje prostih radikalovUvod: Lokalni anestetiki delujejo tako, da inhibirajo napetostno odvisne natrijeve kanale v membrani živčnih vlaken in s tem prenos signala vzdolž aksona. Da dosežejo tarčno mesto, morajo prehajati skozi membrano živčne celice. Kot šibke baze z vrednostmi disociacijske konstante kisline (pKa) med 7 in 10 so pri fiziološkem pH večinoma v protonirani, torej manj lipofilni obliki, ki ima manjšo afiniteto do membrane. V literaturi najdemo precej različnih pojasnil glede vpliva kemijsko-fizikalnih lastnosti lokalnih anestetikov in pH okolice na njihovo farmakokinetiko, saj njihovo obnašanje v celostnem, zapletenem okolju živčnih celic s hidrofilnimi in lipofilnimi predelki ni bilo nikoli dosledno raziskano. Obstajajo dokazi, da imajo lokalni anestetiki antioksidativni učinek, vendar ni jasno, ali delujejo kot neposredni lovilci radikalov ali imajo posreden vpliv na antioksidativni sistem. Namen doktorske naloge je raziskati farmakokinetične lastnosti lokalnih anestetikov s kombinacijo eksperimentalnih in računskih metod ter poiskati povezave med njihovimi farmakokinetičnimi in fizikalno-kemijskimi lastnostmi. Metode: Z uporabo metod računske kemije smo določili prosto energijo prehoda (?G) med vodnim okoljem (zunajcelična tekočina in aksoplazma) ter lipidno membrano. Izdelali smo koncentracijski profil lokalnih anestetikov v ravnotežnem stanju. Upoštevali smo vpliv različnih pH-vrednosti zunajcelične tekočine in aksoplazme na membranski prenos. Z modelom difuzije lokalnih anestetikov, ki smo ga ustvarili, smo proučili njihovo hitrost prehoda skozi biološko membrano. Za dinamično modeliranje prehoda skozi živčno vlakno smo uporabili numerično reševanje enačbe Smoluchowskega, ki je omogočila analizo spreminjanja časovno odvisne koncentracije anestetikov v različnih delih živca. Razvili smo poenostavljeni model živčne celice z uporabo navadnih diferencialnih enačb, s katerim smo lahko simulirali čas do začetka delovanja (angl. onset of action) in trajanje delovanja (angl. duration of action) lokalnih anestetikov. Uporabili smo več različnih laboratorijskih metod za določanje antioksidativne aktivnosti lokalnih anestetikov. Najbolj verjetne reakcije s prostimi radikali smo simulirali z metodami računske kemije. Rezultati: Ugotovili smo, da je samo solvatacijski model, ki temelji na elektronski gostoti (angl. solvation model based on density, SMD), uspel poustvariti eksperimentalne vrednosti porazdelitvenega koeficienta za nevtralne in protonirane zvrsti. Večina lokalnih anestetikov je imela ravnotežno konstanto prehoda iz vodne okolice v membrano večjo od 1. Posledično je bila prosta energija za prehod pri večini primerov negativna. Koncentracija vseh lokalnih anestetikov v fizioloških pogojih je bila v ravnotežnem stanju v aksoplazmi 1.86-krat večja kot v zunajcelični tekočini. Ob lokalni acidozi je bila koncentracija lokalnih anestetikov v aksoplazmi za polovico nižja kot v zunajcelični tekočini. Rešitev difuzijske enačbe je pokazala, da lidokain v membrani živčne celice doseže ravnotežno koncentracijo malo hitreje kot bupivakain, oba pa jo dosežeta v podobnem velikostnem redu, in sicer v milisekundah. Poenostavljeni model živčne celice s štirimi predelki je podal čas do vzpostavitve ravnovesnih koncentracij – približno 4 ms pri lidokainu in 40 ms pri bupivakainu. Simulirani čas do začetka delovanja je bil 167 s za lidokain in 186 s za bupivakain. Simulirano trajanje delovanja je bilo 41 min za lidokain in 328 min za bupivakain. Ob lokalni acidozi sta se pri obeh proučevanih anestetikih skrajšala tako čas do dosega ravnovesne koncentracije kot razpolovni čas praznjenja modela. Vsi trije lokalni anestetiki so pokazali sposobnost za lovljenje radikala 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kisline (ABTS·+), pri čemer je bil lidokain najučinkovitejši. V primerjavi z vitaminom C je lidokain pokazal 200-krat višjo polovično maksimalno inhibitorno koncentracijo (angl. half-maximal inhibitory concentration, IC50), kar pomeni, da so lokalni anestetiki dvesto krat šibkejši lovilci radikalov kot vitamin C. Termodinamično najugodnejša in tudi edina verjetna reakcija je prenos vodikovega atoma med prostim radikalom in skupino -C-H, ki se nahaja poleg karbonilne skupine. Ugotovili smo, da je antioksidativna aktivnost vseh testiranih lokalnih anestetikov v lipofilnem okolju zanemarljiva, kar so dodatno potrdili kvantnokemijski izračuni. Zaključki: Naš model živčnega vlakna je pokazal, da se skoraj vsi lokalni anestetiki kopičijo v membrani in Schwannovih celicah ter da je energijska pregrada za prehod skozi membrano primerljiva z učinkovinami, ki dobro prehajajo krvno-možgansko pregrado. Biološka membrana je torej zanemarljiva kinetična ovira pri prehodu lokalnega anestetika iz zunajcelične tekočine do njegovega receptorja v aksoplazmi in najverjetneje nima vpliva na čas do začetka delovanja anestetika. Lokalni anestetiki difundirajo iz predelkov z višjim pH v predelke z nižjim pH zaradi ugodne solvatacijske proste energije protoniranih zvrsti. Naš model pojasni manjšo učinkovitost lokalnih anestetikov v vnetem tkivu. Trajanje delovanja lokalnih anestetikov je odvisen od razmerja med nakopičenim lokalnim anestetikom v lipofilnih delih živca in hitrostjo izplavljanja lokalnega anestetika s kapilarami. Pri lokalni acidozi je v lipofilnih delih živca nakopičenega precej manj lokalnega anestetika, zato je zato učinek šibkejši. Lokalni anestetiki kažejo zmerno aktivnost pri lovljenju prostih radikalov v vodnem okolju, pri čemer je lidokain pokazal največjo aktivnost. Zdi se, da je njihova antioksidativna aktivnost v lipidnem okolju zanemarljiva.20252025-04-18 07:15:54Doktorsko delo/naloga168588VisID: 30580sl