Vpliv kliničnih in krvnih dejavnikov na biofizikalne in molekularne lastnosti zunajceličnih veziklov, izoliranih iz krvne plazme zdravih odraslihMarić, Ivica (Avtor) Lenassi, Metka (Mentor) zunajcelični veziklikrizdravi odraslibiološka variabilnostreferenčni intervalUvod: Zunajcelični vezikli (ZV) so del kompleksne celične komunikacijske poti. So heterogena skupina membranskih veziklov, ki se razlikujejo po velikosti, zgradbi, poti nastanka in funkciji. Nastajajo lahko znotraj ali na površini celic in se sproščajo zunajcelično do visokih koncentracij (od 106 do 1013/ml krvi odvisno glede na uporabljeno metodologijo). Večina dosedanjih raziskav je bila usmerjena v proučevanje ZV kot bioloških označevalcev patoloških stanj pri človeku, manjka pa poznavanje lastnosti krvnih ZV pri normalnem, fiziološkem stanju ter kateri dejavniki preiskovanca vlivajo na njihove značilnosti. Poznavanje fizioloških ZV bi omogočilo določitev referenčnih vrednosti, ki bi podale okvir in težo številnim študijam v povezavi s patologijo. Namen: V okviru doktorske disertacije smo opredelili biofizikalne (koncentracijo, velikost) in molekularne (površinske proteine) značilnosti ZV, izoliranih iz krvne plazme pri zdravi odrasli populaciji, in preverili njihovo povezavo z nekaterimi demografskimi, kliničnimi in laboratorijskimi dejavniki (spol, starost, ITM, krvni pritisk, kajenje in hemogram). Na podlagi rezultatov smo poskusili predlagati referenčne vrednosti za koncentracijo, velikost ali površinsko proteinsko sestavo ZV kot mero za količino ZV v krvni plazmi zdrave odrasle slovenske populacije. Hipoteze: (1) Koncentracija in velikost zunajceličnih veziklov, izoliranih iz krvne plazme, sta povezani s starostjo, indeksom telesne mase, kajenjem in/ali krvnim pritiskom pri zdravi odrasli populaciji. (2) Razmerje koncentracij podtipov krvnih celic vpliva na koncentracijo in/ali površinsko proteinsko sestavo zunajceličnih veziklov, izoliranih iz krvne plazme pri zdravih odraslih. Metode: Študijo smo izvedli v dveh delih, in sicer v prvem delu smo zbrali klinične vzorce in osnovne demografske, klinične in laboratorijske podatke 208 preiskovancev ter vzpostavili zbirko krvne plazme. Študijo smo opravili na krvodajalcih, za katere menimo, da so zdrava odrasla populacija. V drugem delu smo iz zbranih vzorcev krvne plazme izolirali ZV in izvedli biofizikalno (analiza NTA za določitev koncentracije in velikosti ZV) in biokemijsko (dokazovanje površinskih proteinov ZV s slikovno pretočno citometrijo ter dokazovanje površinskih proteinov tetraspanin-pozitivnih ZV s pomočjo pretočne citometrije z lovilnimi kroglicami) analizo. Dodatno smo preverili kakovost izvedenih postopkov (merjenje preostalih celic v plazmi za izolacijo ZV, merjenje koncentracije lipoproteinov v izolatu ZV, merjenje aktivacije trombocitov) za natančnejšo opredelitev pridobljenih rezultatov. S statistično analizo smo nato preverili povezavo med izmerjeno koncentracijo, velikostjo in prisotnostjo površinskih proteinov ZV s splošnimi kliničnimi dejavniki (npr. spol, starost, krvni pritisk, ITM, kajenje in hemogram). Rezultati: Koncentracija nanodelcev v kohorti zdravih odraslih [/ml plazme] je bila reda 109, merjeno z metodo NTA, oz. povprečje median koncentracij je bilo reda 107, merjeno s slikovno pretočno citometrijo. Glede na površinski proteinski profil ZV smo s slikovno pretočno citometrijo izmerili najvišje koncentracije za subpopulacije ZV, ki izvirajo iz aktiviranih trombocitov in eritrocitov, najnižjo koncentracijo pa za ZV endotelijskega izvora. Glede na površinske celične označevalce so pri tetraspanin-pozitivnih ZV prevladovali ZV trombocitnega in levkocitnega izvora. Stopnjo inter-individualne variabilnosti je bila visoka, s tem da so tetraspanin-pozitivni kazali nižjo stopnjo variabilnosti v primerjavi izmerjenimi koncentracijami ZV s slikovno pretočno citometrijo. V naši študiji so spol, starost, kajenje, krvnoskupinski sistem ABO ter menopavzalni status vplivali na posamezne podskupine ZV. Zaključki: Splošnega vpliva proučevanih dejavnikov na lastnosti ZV nismo dokazali, smo pa dokazali vpliv na določene podskupine ZV, s čimer smo prvo hipotezo le delno potrdili. Drugo hipotezo smo ovrgli, saj koncentracije krvnih celic niso bile povezane s koncentracijo ali proteinsko sestavo krvnih ZV. Prispevek k znanosti: Kot prvi smo natančno opisali fiziološko populacijo ZV v krvi. Dokazali smo, da ZV, sproščeni iz istega celičnega tipa, imajo zelo raznolike in nepovezane profile, zato je smiselno za vsak celični tip meriti več različnih podskupin ZV (uporaba različnih celičnih označevalcev za isti tip celice). Kot prvi smo dokazali vpliv krvnoskupinskega sistema ABO na lastnosti ZV. Pri preučevanju (fiziološkega stanja) ZV je obvezno preverjanje kakovosti plazme in izvedenih postopkov, s čimer lahko natančneje ovrednotimo oz. umestimo rezultate.20252025-04-05 07:15:43Doktorsko delo/naloga168246VisID: 30543sl