Kvantifikacija bakterij Campylobacter jejuni v biofilmih s kapljično digitalno verižno reakcijo s polimerazo ob uporabi propidijevega monoazidaKalan, Polona (Avtor) Klančnik, Anja (Mentor) Campylobacter jejuniPseudomonas fragibiofilmddPCRPMABakterije vrste Campylobacter jejuni so glavni povzročitelji gastroenteritisov pri ljudeh po celem svetu. V naravi jih pretežno najdemo v eno- in večvrstnih biofilmih, kar jim omogoča preživetje v neugodnih okoljskih razmerah. V stresnih razmerah preidejo v živo, vendar nekultivabilno stanje (VBNC), kar onemogoča njihovo kvantifikacijo s klasičnimi metodami, kot je štetje kolonijskih enot (CFU). Celice v stanju VBNC ohranijo virulentni potencial, zato je pomembno razviti metodo, ki bo omogočala hitro in zanesljivo kvantifikacijo vseh živih celic C. jejuni v vzorcu biofilma. Namen magistrske naloge je bil vpeljati in optimizirati metodo kvantifikacije bakterij C. jejuni v eno- in večvrstnih biofilmih z uporabo ddPCR v kombinaciji z reagentom PMA, ki selektivno prehaja skozi membrane poškodovanih celic, se kovalentno veže na DNA in preprečuje pomnoževanje tekom reakcije PCR. Poseben poudarek naloge je bil na optimizaciji tretiranja z reagentom PMA. Izkazalo se je, da pufer PBS ni primeren za pripravo redčitev in spiranja biofilmov v kombinaciji z reagentom PMA ter, da dvakratno tretiranje z reagentom PMA izboljša delovanje reagenta PMA. Dvakratno tretiranje s 25 µM reagentom PMA zagotavlja najboljše rezultate pri zniževanju signala mrtvih celic, brez da bi pri tem vplivali na signal živih celic, kar je bilo potrjeno z metodama qPCR in ddPCR. Z molekularno metodo ddPCR zaznamo več C. jejuni kot z metodo štetja CFU, kar nakazuje na prehajanje celic v stanje VBNC in samo občutljivost metode. S primerjavo metod ddPCR-PMA in CFU smo pokazali, da se sposobnost tvorjenja biofilma C. jejuni izboljša v mešanih biofilmih s Pseudomonas fragi. Glavna težava naše metode je bila kontaminacija z DNA C. jejuni, za katero smo ugotovili, da je prisotna na površinah v laboratoriju in v pipetah in je prisotna kot ozadje pri kvantifikaciji vzorcev. Pred izvajanjem nadaljnjih poskusov in ponovitvijo nekaterih korakov optimizacije, bi bilo potrebno kontaminacijo odstraniti in odslej uporabljati nastavke za pipete s filtrom.[P. Kalan]20252025-03-21 07:15:24Magistrsko delo/naloga167945UDK: 582.23:577.1(043.2)VisID: 257171COBISS_ID: 229774595sl