Vpliv reverzne transkripcije na določanje količine tarčne RNA pri SARS-CoV-2Nechevska, Anastasija (Avtor) Milavec, Mojca (Mentor) RT-qPCRRT-dPCRSARS-CoV-2Izbira pravilne diagnostične metode je ključna za zagotavljanje natančnih in zanesljivih rezultatov pri odkrivanju virusov. To predstavlja poseben izziv pri RNA-virusih, kot je SARS-CoV-2, saj je v tem primeru najprej treba izvesti reverzno transkripcijo (RT), kar lahko pomembno vpliva na rezultate analize. Za diagnozo virusa SARS-CoV-2 kot zlati standard velja metoda RT in kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR) zaradi svoje izjemne natančnosti, enostavnosti izvedbe ter občutljivosti pri zaznavanju in kvantifikaciji virusne RNA. Kljub tem prednostim lahko pri zelo nizkih koncentracijah virusa pride do lažno negativnih rezultatov. Alternativna metoda je RT in digitalne verižne reakcije s polimerazo (RT-dPCR), ki omogoča absolutno kvantifikacijo in zaznavanje virusa pri zelo nizkih koncentracijah, kar je ključno v zgodnjih fazah okužbe. V okviru magistrske naloge smo z metodama RT-qPCR in RT-dPCR izvedli analize na dveh vrstah vzorcev: (1) sintetičnih segmentih virusa SARS-CoV-2, ki vsebujejo značilna zaporedja genoma virusa, in (2) genomski RNA (gRNA), izolirani iz virusov gojenih na celičnih kulturah. Uporabili smo različne komercialno dostopne enostopenjske in dvostopenjske RT-komplete in primerjali njihovo učinkovitost in natančnost pri zaznavanju za virus SARS-CoV-2 značilnih nukleinskih zaporedij. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili zapis za encim luciferazo (LUC), ki se pogosto uporablja kot kontrola prisotnosti inhibitorjev RT v reakciji. Ugotovili smo, da so enostopenjski kompleti boljša izbira pri obeh metodah, tako za segmente RNA kot za gRNA, saj smo dobili primerljive vrednosti za izbrane tarče virusa. Pri sintetičnih segmentih RNA smo z nekaterimi dvostopenjskimi kompleti dobili višje vrednosti kot z enostopenjskimi kompleti, a hkrati smo opazili visoko variabilnost med tarčami. Kontrola LUC se je izkazala kot neustrezna izbira, saj smo z obema pristopoma (enostopenjski in dvostopenjski) v primeru obeh metod (RT-qPCR in RT-dPCR) dobili visoke in med seboj neprimerljive rezultate. Pokazali smo, da obe metodi sicer učinkovito delujeta pri zaznavanju in kvantifikaciji virusne RNA, vendar je bila med rezultati (vrednosti Cq) posameznih metod RT-qPCR velika variabilnost, kar pomeni, da vrednosti Cq ne moremo neposredno uporabljati za diagnostične namene. Pokazali smo tudi, da metoda analize in izbira kompletov reagentov pomembno vplivata na zanesljivost in ponovljivost rezultatov, kar je ključno za učinkovito diagnosticiranje virusa SARS-CoV-2.20252025-02-11 09:10:00Magistrsko delo/naloga167164VisID: 22818COBISS_ID: 226174723sl