Razvoj metod za povečanje donosa zunajceličnih heterolognih proteinov izraženih v bakteriji Streptomyces rimosusPšeničnik, Alen (Avtor) Petković, Hrvoje (Mentor) Streptomyces rimosusheterologni proteiniCRISPR-Casmolekularna orodjaredukcija genomaoksitetraciklineksoproteombioinformacijska analizausmerjena evolucijafluorescentni proteiniNamen doktorske naloge je razvoj novih metod za detekcijo in povečanje koncentracije heterolognih zunajceličnih proteinov pri bakteriji S. rimosus oz. preizkusiti več različnih pristopov ter ovrednotiti njihovo uporabnost. V začetnem delu smo poenostavili dosedanje načine detekcije zunajceličnih proteinov z uporabo različnih fluorescentnih proteinov. Z analizo ekso-proteoma smo pridobili nove informacije o najbolj zastopanih zunajceličnih proteinih, te informacije smo nato uporabili pri dizajnu ekspresijskih kaset. Z dodatkom poročevalskega sistema smo optimizirali molekularno orodje CRISPR-Cas9 in sam postopek izvajanja delecij s tem orodjem v bakteriji S. rimosus. Razvit sistem Cas9_SD_GusA je uporaben tudi pri inženiringu drugih bakterij, kjer CRISPR orodje ne deluje dobro. Zasnovali in testirali smo tudi sistem usmerjene evolucije na osnovi eritromicinske esteraze EreB, ki omogoča povečevanje količine tarčnega proteina. Z optimiziranim sistemom CRISPR smo izvedli delecije večjih odsekov genoma S. rimosus, in ustvarili metabolno očiščen sev S. rimosus ATCC Δotc Δ145kb, ki ne proizvaja nobenega od glavnih metabolitov te bakterije (rimocidini, oksitetraciklin) in je zato teoretično bolj primeren za industrijsko proizvodnjo heterolognih proteinov in drugih produktov. V konstruiranem sevu smo nato testirali delovanje verzij fuzijskega proteina mCherry-kaminizin in ovrednotili delovanje tega poročevalskega sistema za proizvodnjo industrijsko relevantne proteaze Kaminizin. Rezultati opravljenega dela kažejo prednosti in omejitve vsakega izmed testiranih pristopov ter ustvarjajo podlago za nadaljnji razvoja gostiteljskega organizma S. rimosus za produkcijo heterolognih proteinov in drugih produktov.20242024-12-12 13:30:56Doktorsko delo/naloga165875VisID: 255827COBISS_ID: 218967811sl