Optimizacija postopka za pripravo človeških monoklonskih protiteles iz periferne krvi imuniziranih darovalcev na modelu hepatitisa BOmejec, Sandra (Avtor) Čurin Šerbec, Vladka (Mentor) človeško monoklonsko protiteloposamične celice Bvirus hepatitisa BRekombinantna človeška monoklonska protitelesa zaradi svojih lastnosti predstavljajo pomembno skupino bioloških zdravil. V zadnjih dveh desetletjih je v porastu razvoj tehnologij posamične celice B, ki omogočajo pripravo človeških monoklonskih protiteles iz posamične celice B imuniziranih darovalcev. V okviru doktorske disertacije smo želeli uporabiti obstoječe tehnologije in metode ter jih izboljšati in prilagoditi na razpoložljivo opremo v laboratoriju. Darovalcem, cepljenim proti virusu hepatitisa B smo odvzeli periferno kri 7. in 14. dan po poživitvenem odmerku cepiva, saj je takrat v krvi prisotnih največ za antigen specifičnih celic B. Ključni koraki pri optimizaciji postopka so bili izbira prave tehnologije za osamitev posamične specifične celice B, postavitev učinkovitega protokola za RT-PCR iz posamične celice B in razvoj metode za preverjanje specifičnosti proizvedenih monoklonskih protiteles. Ločevanje celic na celičnem ločevalcu se je za osamitev posamične specifične celice B izkazalo za najbolj zanesljivega. Učinkovitost ločevanja smo povečali s predhodnim dodatnim korakom obogatitve celic B. Kljub manjšemu naboru površinskih označevalcev ločevanja (CD19, CD27, IgG in BCR za HBsAg) od prejšnjih študij, smo uspešno osamili za HBsAg specifične plazmatske in spominske celice B. Delež omenjenih specifičnih celic je bil 0,05-0,07 % od vseh celic B, osamljenih iz periferne krvi cepljenih darovalcev. Najbolj uspešen postopek za obratni prepis mRNA variabilnih genskih segmentov je bil protokol z reverzno transkriptazo SuperScriptIV in naključnimi oligonukleotidi. Za pomnoževanje produkta obratnega prepisa je bil najuspešnejši protokol z degeneriranimi začetnimi nukleotidi in polimerazo KAPAHifi. S kloniranjem variabilnih delov v plazmid smo uspeli pripraviti 5 plazmidov z variabilnim delom težke verige in 5 plazmidov z variabilnim delom lahke kapa verige. Po kotransfekciji parov plazmidov v sesalčjo linijo HEK293T/17 je 70 % od transficiranih celic proizvajalo protitelesa. Za preverjanje specifičnosti pripravljenih protiteles smo razvili specifični HBsAg ELISA test, ki je pokazal, da imajo tri pripravljena protitelesa sposobnost vezave na HBsAg. Postavili smo preprost in učinkovit postopek za pripravo rekombinanatnega monoklonskega protitelesa iz posamične celice B iz periferne krvi imuniziranih darovalcev na modelu hepatitisa B, s katerim lahko pripravimo specifično človeško monoklonsko protitelo tudi proti drugim antigenom za uporabo v raziskavah ali na področju personalizirane biomedicine.20242024-11-28 07:15:53Doktorsko delo/naloga165242VisID: 30267sl