Odkrivanje mutacij po tarčnem preurejanju genoma zelja (Brassica oleracea var. capitata) z metodama qPCR in dPCRJavornik, Žiga (Avtor) Štajner, Nataša (Mentor) Stajič, Ester (Komentor) CRISPR/Cas9dPCRqPCRNGScenh3haploidiZa genetsko preurejanje rastlin se danes najpogosteje uporablja sistem CRISPR/Cas9, ki nam omogoča tarčno preurejanje rastlinskih genov z visoko natančnostjo. CRISPR/Cas sistem je bil sprva odkrit pri bakterijah in arhejah, kjer vodilna RNA prepozna virusno DNA, in jo z endonukleazo razreže na manjše fragmente. Za preurejanje rastlinskega genoma je potrebno sintetizirati komplementarno gRNA zaporedje, ki se veže na gen, ki ga preurejamo. Tarčno preurejanje genov s CRISPR/Cas9 sistemom se uporablja za raziskovanje funkcije genov, preučevanje genske regulacije in razvoj rastlin z izboljšanimi lastnostmi. Ta metoda je tudi časovno in stroškovno učinkovitejša v primerjavi s tradicionalnimi tehnikami genske modifikacije. Po tarčnem preurejanju genoma potrebujemo hitro, enostavno, natančno in cenovno ugodno metodo, s katero lahko potrdimo uspešnost nastanka genetskih preureditev naših vzorcev. V okviru magistrske naloge smo vzpostavili metodi dPCR in qPCR za detekcijo mutacij po tarčnem preurejanju gena cenh3 s tehnologijo CRISPR/Cas9. Z metodo qPCR smo 75 % testiranim vzorcem uspešno potrdili nastanek induciranih mutacij po tarčnem preurejanju genoma, z metodo dPCR pa 89 % testiranim vzorcem. Deleže mutacij dobljenih z metodama qPCR in dPCR smo primerjali z rezultati NGS analize in ugotovili, da smo z metodo dPCR določili bolj primerljive odstotke mutacij kot z metodo qPCR. Na podlagi naših rezultatov bi lahko obe metodi uporabili za uspešno potrditev mutacij po tarčnem preurejanju genoma s CRISPR/Cas9 sistemom, s čimer bi znižali finančni in časovni vložek raziskav.20242024-10-17 07:15:38Magistrsko delo/naloga164116VisID: 248337COBISS_ID: 211959043sl