Priprava, vrednotenje in uporaba kontrolnih materialov za določanje koncentracije virusa opičjih koz z verižno reakcijo s polimerazoŠulin, Mija (Avtor) Bogožalec Košir, Alexandra (Mentor) dPCRkontrolni materialvirus opičjih kozZa zanesljivo diagnostiko z molekularnimi metodami potrebujemo kontrolne materiale, ki med drugim omogočajo primerjavo rezultatov med laboratoriji. Uporaba kontrolnih materialov je zelo pomembna pri razvoju novih testov, natančni kvantifikaciji genetskega materiala, z njimi tudi upoštevamo in kompenziramo človeške napake med izvedbo analize. Za vrednotenje kontrolnih materialov, ki so nukleinske kisline, uporabljamo digitalno verižno reakcijo s polimerazo (dPCR), ki omogoča povezljivost na najvišjo meroslovno raven, do SI enot. Omogoča absolutno kvantifikacijo nukleinskih kislin, kar pomeni, da za kvantifikacijo ne potrebuje kalibracijske krivulje. Metoda je tudi ponovljiva, natančna in manj dovzetna za inhibicijo kot kvantitativni PCR (qPCR). Posledično ima dPCR velik pomen za raziskovalne in diagnostične aplikacije. V magistrskem delu smo pripravili, ovrednotili in uporabili kontrolni material za kvantifikacijo virusa opičjih koz s qPCR. Najprej smo pripravili kontrolni material iz sintetične DNA, in sicer: v vodi (H$_2$O), v vodi z dodano nosilno DNA iz spermijev lososa (ssH$_2$O) ter v vodi z dodano nosilno DNA iz priželjca teleta (ctH$_2$O). Kontrolni material je bil shranjen pri dveh temperaturah (–20 °C in –80 °C). Z metodo dPCR smo materialu določili koncentracijo, ovrednotili tako homogenosti med kot znotraj vzorca ter testirali dolgotrajno in kratkotrajno stabilnost. Ugotovili smo, da je kontrolni material iz sintetične DNA najstabilnejši v ssH$_2$O, shranjen pri temperaturi –80 °C, zato smo pri pripravi kontrolnega materiala iz genomske DNA (gDNA) uporabili te pogoje. Kontrolni material iz gDNA je pri teh pogojih stabilen, ohrani homogenost in koncentracijo. Pri ovrednotenju materiala iz gDNA smo primerjali tudi dve platformi za dPCR (QX200 Droplet Digital PCR (Bio-Rad) in Naica System 6-color Digital PCR (Stilla Technologies)), ki sta dali primerljive rezultate. Ko smo imeli pripravljen kontrolni material, smo ga uporabili za kvantifikacijo virusa opičjih koz in virusa vakcinije v vzorcih z metodo qPCR. Rezultate kvantifikacije virusov smo nato primerjali z metodo dPCR. Čeprav je med rezultati pristranskost višja od 25 %, so rezultati pri virusu opičjih koz primerljivi, ker je bila koncentracija virusa nizka in pomembno je bilo to, da smo virus zaznali. Za umeritveno krivuljo smo uporabili sintetično DNA, zato primerjava vzorcev ni bila optimalna, ker je pri vzorcih različnih kompleksnosti lahko učinkovitost pomnoževanja različna.20242024-10-16 08:38:33Magistrsko delo/naloga164033VisID: 22789COBISS_ID: 217832451sl