Razvoj rekombinantnih sevov Lactococcus lactis s sposobnostjo dostave proteinskih antagonistov receptorjev za IL-6 in IL-22Volarič, Nejka (Avtor) Berlec, Aleš (Mentor) Plavec, Tina Vida (Komentor) Lactococcus lactisrekombinantni proteiniproteinski vezalcipovršinska predstavitevbakterijski vezikliPogost krivec za razvoj avtoimunskih bolezni in rakavih sprememb je pretirano ali nenadzorovano izražanje citokinov. Citokini so majhne proteinske in glikoproteinske molekule, ki lahko delujejo provnetno ali protivnetno in v telesu opravljajo vlogo komunikacijskega dejavnika med celicami, zlasti pri imunskem odzivu. Dva citokina, ki imata takšno vlogo pri delovanju imunskega sistema, sta tudi IL-6 in IL-22. Z namenom, da bi zavrli njuno pretirano delovanje, smo v okviru magistrske naloge želeli pripraviti genske konstrukte z zapisom za antagoniste njunih receptorjev IL-6Rα in IL-22Rα1. Za zdravljenje avtoimunskih bolezni in raka s pomočjo nevtralizacije citokinskega signaliziranja je trenutno najbolj pogosta uporaba monoklonskih protiteles, ki pa imajo veliko pomankljivosti. Zaradi tega se razvijajo tudi majhni proteinski vezalci neimunoglobulinskega izvora, ki imajo nekatere boljše lastnosti in smo jih zato uporabili tudi v tej magistrski nalogi. Kot gostiteljski organizem in dostavni sistem smo uporabili bakterije Lactococcus lactis, ki zaradi svojih lastnosti lahko preživijo prehod skozi gastrointestinalni trakt. V plazmida pSDBA3b in pSD-Her2-Flag, ki zaradi zapisa za signalni peptid Usp45 in sidrno domeno cAcmA omogočata predstavitev vezalcev na bakterijski površini, smo vstavili gene za neimunoglobulinske vezalce ABR099S, ABR167, NEF108 in NEF163. Vezalce, predstavljene na površini bakterij, smo analizirali z metodo točkovnega nanosa, konfokalno mikroskopijo, z NaDS-PAGE, ki mu je sledil prenos Western (detekcija s protitelesi proti Flag oznaki) ter z metodo pretočne citometrije. Vse metode so potrdile prisotnost vseh vezalcev na površini, pri čemer sta bila v največjem obsegu prisotna Flag-ABR099S in Flag-NEF108. Z metodo NaDS-PAGE in prenosom Western smo potrdili tudi prisotnost vezalcev z oznako Flag v gojišču, kjer so ostali zaradi nepopolne pritrditve sidrne domene na celično steno bakterij po sprostitivi rekombinantnih proteinov iz bakterije. S pretočno citometrijo smo detektirali vezavo proteinov na želene receptorje, ki pa je bila dokaj šibka. Najučinkovitejša je bila vezava proteina Flag-NEF108 na receptor IL-6Rα. Ker je trenutno zelo aktualno tudi področje uporabe postbiotikov, kamor lahko štejemo tudi zunajcelične vezikle, smo preizkusili, če bakterija L. lactis tvori zunajcelične vezikle, in analizirali, če izločeni vezikli vsebujejo rekombinantne proteine. Prisotnost veziklov v vzorcih smo po izolaciji potrdili z elektronskim mikroskopom. Izolirane vezikle smo analizirali z metodo NaDS-PAGE in prenosom po Westernu ter potrdili prisotnost izraženih vezalcev tudi v bakterijskih veziklih.20242024-09-13 07:45:40Magistrsko delo/naloga161669VisID: 108090sl