Karakterizacija glikoziltransferaze, udeležene v sintezi sekundarnega polisaharida bakterije Clostridioides difficileUršič, Tadej (Avtor) Turk, Dušan (Mentor) Taler-Verčič, Ajda (Komentor) PSIICD630_27760Clostridioides difficileglikoziltransferazaBakterija Clostridioides difficile (C. difficile) je v naravi zelo razširjena po Gramu pozitivna sporogena bakterija. Je pomemben bolnišnični patogen, ki povzroča z antibiotiki povezano diarejo. Okužba z bakterijo pa lahko vodi tudi do resnejših zapletov, kot so psevdomembranski kolitis, sepsa, sindrom multiorganske disfunkcije in celo smrt. Površino bakterije pokriva urejena plast proteinov, ki tvorijo t. i. površinsko (S-) plast. S-plast je pomembna za obrambo bakterije, njeno adhezijo in sporulacijo, je pa tudi pomemben virulenčni dejavnik. S-plast je v celično steno usidrana preko nekovalentne interakcije s sekundarnim polisaharidom PSII. PSII je za C. difficile specifičen anionski polisaharid, ki je sestavljen iz ponavljajočih se heksaglikozilfosfatnih enot. Proteini, ki sodelujejo v biosintezni poti PSII, so slabo raziskani, in so potencialne tarče za razvoj novih načinov za zdravljenja okužbe s C. difficile. V tem magistrskem delu smo se osredotočili na protein CD630_27760, ki ima glikoziltransferazno aktivnost in sodeluje pri biosintezi osnovne heksaglikozilfosfatne enote PSII. Katalizira prenos sladkorja s sladkornega donorja, ki je ali UDP-glukoza (UDP-Glc) ali UDP-N-acetilgalaktozamin (UDP-NAcGal), na akceptor, ki je nastajajoča sladkorna enota, vezana na undekaprenil pirofosfat (UndPP). Sodelavci iz raziskovalne skupine so protein predhodno že uspešno izrazili v bakterijskih celicah Escherichia coli (E. coli) in določili njegovo tridimenzionalno strukturo. Opazili pa so, da pri izražanju proteina pride do spontane cepitve C-končnega dela proteina. V prvem delu magistrske naloge smo z masno spektrometrijo (MALDI-TOF) določili, da do cepitve pride na treh mestih in dobimo tri fragmente: 27,1 kDa, 26,6 kDa in 24,3 kDa. Njihova pozicija se sklada s predvideno pozicijo cepitve C-končnega dela. V drugem delu smo s kokristalizacijo poskusili pripraviti kristale kompleksov proteina s predvidenima sladkornima donorjema (UDP-Glc ali UDP-NAcGal) in potencialnimi inhibitorji, vendar nam to ni uspelo. S primerjavo zaporedja in strukture proteina CD630_27760 s homolognimi proteini smo in silico določili aminokislinske ostanke, ki so pomembni za interakcijo z nukleotidnim delom sladkornega donorja: P12, L14, R16, N42, K69, R75, D91, D92, D93 in H205. Primerjava s homologi je tudi pokazala, da ima C-končni del proteina, ki se tekom izolacije spontano odcepi, pomembno vlogo pri vezavi sladkorne enote donorja in akceptorja. Zato bo za pridobitev strukture z vezanim sladkornim donorjem in/ali inhibitorjem potrebno pripraviti protein v polni dolžini, ki bo vseboval tudi C-končni del.20242024-09-12 15:10:00Magistrsko delo/naloga161624VisID: 25343COBISS_ID: 215960067sl