Možnosti uporabe protismiselnih oligonukleotidov pri aktivaciji izražanja tarčnih genov s kratkimi aktivirajočimi molekulami RNAGodeša, Ana (Avtor) Sušjan Leite, Petra (Mentor) Novinec, Marko (Komentor) redke genetske boleznigenska terapijakratke aktivirajoče RNAAGO2protismiselni oligonukleotidiAktivacija z RNA (angl. RNA activation, RNAa) je mehanizem, pri katerem kratka aktivirajoča RNA (angl. small activating RNA, saRNA) v sodelovanju s proteinom Argonaut 2 (AGO2) in kompleksom RITA, ojača izražanje tarčnih genov preko vezave na njihovo promotorsko regijo. Zaradi zmernega povišanja izražanja genov se zdi obetavna za uporabo v terapiji redkih nevrorazvojnih bolezni, kjer prizadeti geni delujejo v strogo reguliranem območju aktivacije in zato lahko patološki fenotip povzročajo tako ob znižanem kot tudi prekomernem izražanju. V magistrski nalogi smo na podlagi obstoječih saRNA p21 in CEBPA, ki so že v kliničnih poskusih, načrtovali enoverižne protismiselne oligonukleotide (angl. antisense oligonucleotides, ASO) in preverili, če z njimi lahko posnemamo delovanje saRNA. Protismiselni oligunukleotidi so namreč enostavnejši za dostavo v celice in manj imunogeni kot dvoverižne RNA. S protismiselnima oligonukleotidoma ASO p21 in ASO CEBPA smo uspešno aktivirali izražanje tarčnih genov p21 in CEBPA, kar smo preverili s kvantifikacijo mRNA tarčnih genov s qPCR in z detekcijo proteinov s prenosom western. Aktivnost saRNA je odvisna od vezave na protein AGO2, zato smo z metodami imunoprecipitacije in s površinsko plazmonsko resonanco (SPR) preverjali ali se načrtovani protismiselni oligonukleotid specifično veže na AGO2 ter vezavo z SPR tudi potrdili. Nato smo na podlagi obstoječih smernic načrtovali nove saRNA, ki ciljajo razvojno pomembne gene ABCD1, ZC4H2 in SYNGAP1 in CTNNB1, povezane z redkimi, neozdravljivimi monogenskimi boleznimi in spremljali njihovo aktivacijo izražanja s qPCR. Izmed petih novih načrtovanih saRNA smo s tremi kandidati na različnih celičnih linijah dosegli nizko aktivacijo izražanja genov, kar nam bo v prihodnjih raziskavah služilo kot osnova za nadaljnjo optimizacijo zaporedja in načrtovanje protismiselnih oligonukleotidov.20242024-09-12 13:30:00Magistrsko delo/naloga161600VisID: 24266COBISS_ID: 215176195sl