Kloniranje in priprava MLKL (L38C, W109C) v bakteriji Escherichia coliJošt, Lev (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) MLKLnekroptozadisulfidni mostičekMLKL velja za izvršilca nekroptoze, oblike programirane nekrotične celične smrti, ki poteče, kadar je aktivnost kaspaz onemogočena. S preučevanjem zgradbe N-končnega svežnja štirih alfa-vijačnic MLKL smo ugotovili, da alfa-vijačnici H2 in H5 nista tesno pakirani in sta zato najbolj primerni za uvajanje mutacij in posledično disulfidnega mostička. Disulfidni mostiček bi lahko preprečil razprtje N-končnega svežnja štirih -vijačnic, ki je verjetno potrebno za efektorsko funkcijo MLKL, in s tem onemogočil ali oligomerizacijo ali pa vgraditev proteina v membrano. Cisteinska mutanta smo uvedli na mestu Leu 38 in na mestu Trp 109. Mutaciji smo uvedli v zapis za MLKL v vektorju pE SUMOpro Amp z vključkom opt1 (MLKL1, s kodonom optimiziranim za E. coli). Obe mutaciji sta uspeli, kar smo potrdili z določanjem nukleotidnega zaporedja. Zapis za SUMO-optMLKL1, v katerega smo uvedli mutaciji, smo s pomočjo IVA kloniranja vstavili v ekspresijski vektor pET22b-pelB. NaDS-PAGE analiza vzorcev poskusnega izražanja fuzijskega proteina v bakterijskih celicah E. coli seva BL21[DE3] in BL21 [DE3]pLysS kaže da se protein izraža v netopni frakciji. Le pri izražanju v sevu BL21 [DE3]pLysS pri 18 °C je nekaj proteina tudi topnega.20242024-09-10 13:25:18Diplomsko delo/naloga161376VisID: 24280COBISS_ID: 214992643sl