Encimsko katalizirana tvorba kovalentno povezanih dimerov cisteinske proteaze ksilelainPoljanšek, Aleš (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) Kovalentno povezovanjeksilelaintirozinazaSnoopLigazaOligomerni proteini so proteini, sestavljeni iz več polipeptidnih verig. Med encimi prevladujejo homodimeri, tj. dimeri, kjer sta obe podenoti enaki. S prečnim kovalentnim povezovanjem proteina lahko izboljšamo njegovo stabilnost, povečamo specifičnost in kompleksnost reakcij, dosežemo pa lahko tudi alosterične in kooperativne učinke, ki povečajo hitrost reakcije. Nespecifično oligomerizacijo proteinov lahko dosežemo na več različnih načinov, pri čemer se najpogosteje proteine kovalentno poveže s prečnimi povezovalci. Cilj diplomske naloge je bil prečno kovalentno povezati ksilelain, ki je ekstracelularna cisteinska proteaza, ki izhaja iz bakterije vrste Xylella fastidiosa. Rekombinantna ksilelaina z dodanim tirozinskim aminokislinskim ostankom in z dodanim cisteinskim aminokislinskim ostankom, izražena in izolirana iz E. coli, smo kovalentno povezali z uporabo tirozinaze. To je encim, ki oksidira tirozin v o-kinon, slednji pa nato reagira s tiolno skupino cisteinskega aminokislinskega ostanka. Kovalentno povezovanje ksilelaina s pomočjo tirozinaze se kljub našim poskusom optimizacije ni izkazala za učinkovito, poleg tega pa nam ni uspelo izolirati dimera ksilelaina, zato smo ksilelain kovalentno povezali še z uporabo SnoopLigaze, kjer smo s tem encimom povezali ksilelaina s SnoopTagJr in z DogTag oznako. Da bi preverili, ali ima približanje obeh podenot ksilelaina alosterične učinke, smo pri obeh pridobljenih dimerih ksilelaina izmerili še učinek heparina na aktivnost dimera. Dimer ksilelaina, kovalentno povezan s SnoopLigazo, ni bil aktiven, zato smo odvisnost aktivnosti dimera ksilelaina od koncentracije heparina merili v mešanici dimera, kovalentno povezanega s tirozinazo, in nezreagiranega ksilelaina. Izmerili smo, da je K$_{0,5}^h$ heparina 0,337 µg/mL, F$_\infty$ mešanice pa je 36,9 %.20242024-09-09 12:50:00Diplomsko delo/naloga161299VisID: 24111COBISS_ID: 214203139sl