Priprava aktivne oblike proteina karboanhidraza iz navadnega repnjakovca in optimizacija protokola za spremljanje njegove aktivnostiZupanc, Lara (Avtor) Taler-Verčič, Ajda (Mentor) jodbeta karboanhidraza 1bakterijski ekspresijski sistemnikelj afinitetna kromatografijapH indikatorjiBeta karboanhidraza 1 (βCA1) je metaloencim, ki katalizira reverzibilno pretvorbo CO$_2$ in H$_2$O v HCO$_3^-$ in H$^+$. Prisotna je predvsem v listih rastlin in je posredno vpletena v proces fotosinteze, saj ima vlogo pri vzdrževanju CO$_2$ v bližini encima RuBisCO. Zaradi prisotnosti v listih in sposobnosti vezave joda, je βCA1 pomemben kandidat za raziskave biofortifikacije rastlin z jodom. Jod je v rastlinah namreč poleg v anorganski in organski obliki prisoten tudi vezan na proteine preko določenih aminokislinskih ostankov. Najpogosteje se veže preko tirozinskega aminokislinskega ostanka. Biofortifikacija užitnih rastlin z jodom bi povečala vsebnost joda v prehrani ljudi in tako zmanjšala njegovo pomankanje ter s tem povezane bolezni. Namen našega dela je bilo uspešno izraziti aktivno obliko proteina βCA1 iz rastline navadni repnjakovec (Arabidopsis thaliana) v bakterijskem ekspresijskem sistemu. Izražen protein smo očistili z nikelj afinitetno kromatografijo in postopek čiščenja tudi optimizirali. Z namenom preverjanja aktivnosti izraženega encima smo želeli vzpostaviti test aktivnosti na podlagi pH indikatorjev. Potrdili smo, da je rastlinski protein βCA1 mogoče izraziti v bakterijskem ekspresijskem sistemu ter ga očistiti z Ni-afinitetno kromatografijo. Vzpostavili smo test aktivnosti na podlagi pH indikatorja bromtimol modro, ki se je sicer izkazal za učinkovitega, vendar ga je potrebno še optimizirati. V prihodnje bo test aktivnosti uporaben za primerjanjeaktivnosti jodiranega in nejodiranega encima βCA1.20242024-09-09 10:16:47Diplomsko delo/naloga161278VisID: 24238COBISS_ID: 208324099sl