Ultrazvočna aktivacija ionskih kanalov občutljivih na mehansko motnjoŠetina, Sergeja (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) biotehnologijakalcijeva signalizacijaultrazvokionski kanali TRPKalcijevi ioni so pomembni sekundarni sporočevalci v celici, kjer nadzorujejo vrsto celičnih procesov. Mednje spada tudi aktivacija transkripcijskega dejavnika NFAT, ki uravnava izražanje različnih genov. Vnos kalcija v citosol poteka preko transmembranskih ionskih kanalov, kot so kanali družine TRP. Mnogi med njimi so občutljivi na mehanske dražljaje. Povezava sistema kalcijevih signalnih poti s transgeni in molekulami, ki zaznavajo zunanji dražljaj, omogoča nadzor nad delovanjem celice. Eno od možnih orodij nadzora je ultrazvok, ki omogoča neinvazivno in visoko specifično stimulacijo celic. Preverjali smo delovanje ionskih kanalov TRPA1, TRPC1, TRPC3, TRPV1 ter TRPV4, na katere smo tudi vezali proteine eGFP, BFP ali BFP-gs10-P4. Delovanje kanalov smo preverjali z reporterskim sistemom, ki je vključeval kresničkino luciferazo z desetimi mesti za vezavo NFAT (10AB Pmin fluc) in umetni transkripcijski dejavnik NFAT (mNFAT:TALE:VP16:KRφ), čigar delovanje je odvisno od kalcievih ionov v citosolu. Pokazali smo, da povečano izražanje ionskih kanalov lahko vpliva na prehajanje kalcijevih ionov v citosol nestimuliranih celic in posledično izražanje reporterskega gena. Dobro samoregulacijo so pokazali TRPV4, TRPC1 in vsi njegovi konstrukti ter konstrukti kanala TRPA1. Mehansko občutljivost kanalov smo preverjali z ultrazvočno stimulacijo. Celice s prekomerno izraženimi kanali TRPC1 in TRPV4 so pokazale le rahlo izboljšan odziv na ultrazvok, medtem ko je bil odziv TRPC3 in TRPV1 bolj izrazit. Ker si ne želimo aktivnosti v neinduciranih celicah, je pomembno, da v nadaljnjih raziskavah uporabimo primerno količino kanala oz. konstrukta, ki je dobro reguliran in ne sproži nezaželene transkripcije reporterja npr. kanal TRPC1.20242024-09-04 07:15:41Magistrsko delo/naloga160720VisID: 243301COBISS_ID: 206363907sl