Priprava in izolacija mutante ATPazne domene giraze B R136CHedžet, Tajda (Avtor) Pečar Fonović, Urša (Mentor) giraza Btočkovna mutacija R136CekspresijaE. coli NiCo21IMACDNA-giraza je encim iz skupine topoizomeraz IIA, znana kot pogosta tarča protimikrobnih učinkovin. Encim je sestavljen iz dveh podenot; giraze A in giraze B. Podenota B vsebuje ATPazno domeno, ki je odgovorna za hidrolizo ATP in za normalno delovanje encima. Kinoloni so razred protimikrobnih učinkovin, ki deluje tako, da se veže na podenoto A DNA-giraze in stabilizira kompleks med encimom in molekulo DNA. Bakterije so se z evolucijo na delovanje antibiotikov prilagodile s spontanimi mutacijami, s katerimi so pridobile odpornost proti tem učinkovinam. Ena izmed klinično pomembnih mutacij je mutacija arginina 136 v cistein (R136C) na ATPazni domeni giraze B. V pomoč raziskovalcem pri načrtovanju in vrednotenju zaviralcev giraze DNA smo z metodo mestnospecifične mutageneze s prekrivajočima oligonukleotidoma pripravili mutanto ATPazne domene giraze B R136C. S tremi zaporednimi verižnimi reakcijami s polimerazo smo z ustreznimi začetnimi oligonukleotidi, ki nosijo mutacijo, v zaporedje giraze B vnesli točkovno mutacijo. Na 136. mestu smo v tripletu CGC, ki kodira aminokislino arginin, zamenjali eno bazo tako, da smo dobili triplet TGC, ki kodira aminokislino cistein. Dobljeni produkt verižne reakcije s polimerazo smo očistili, rezali in ligirali v prav tako ustrezno rezan plazmid pET44. S tako pripravljenim vektorjem smo transformirali klonirni sev E. coli TOP 10 in ga kasneje prestavili v ekspresijski sev E. coli NiCo21, v katerem smo mutanto giraze tudi izrazili. Uspešnost mutageneze smo preverili s sekvenciranjem. Mutanto smo očistili z afinitetno kromatografijo IMAC (kovinsko-kelatna afinitetna kromatografija) in gelsko filtracijo (razsolitvena kolona) na sistemu ÄKTA. Prisotnost mutante v dobljenih frakcijah smo potrdili s SDS-PAGE in prenosom western. Izolirali smo 3,74 mg mutante ATPazne domene giraze B R136C.20242024-08-31 07:45:22Diplomsko delo/naloga160578VisID: 107326sl