Uporaba kokulture celičnih linij THP-1 in Jurkat za določanje imunosupresivnega delovanja spojinPollak Sicherl, Pika (Avtor) Sollner Dolenc, Marija (Mentor) Franko, Nina (Komentor) kokultura imunosupresija in vitro metoda metoda novega pristopa citokiniImunski sistem predstavlja kompleksno mrežo organov, tkiv in imunskih celic, ki prepoznavajo lastno in tuje ter tako organizem ščitijo pred tujki. V primeru neustreznega delovanja pride do porušenja homeostaze, kar vodi v razvoj bolezni ali celo smrti posameznika. Zato so potrebne metode, ki prepoznavajo spojine z imunomodulatornim delovanjem, da lahko ocenimo tveganje, ki spremlja izpostavljenost določeni spojini. Določanje imunosupresivnega delovanja spojin danes temelji na živalskih modelih, a se razvija vedno več alternativnih in vitro ter in silico metod, ki naj bi v prihodnosti nadomestile obstoječe teste. V ta namen je bil razvit in vitro model kot alternativa testu izločanja citokinov v človeški polni krvi, saj je ta zaradi uporabe vzorcev različnih posameznikov omejen z interindividualnimi razlikami. Razviti model temelji na uporabi kokulture celičnih linij THP-1 in Jurkat, ki predstavljajo monocite in limfocite T. Z uporabo znanih imunosupresivnih spojin z različnimi mehanizmi delovanja smo ocenili ustreznost razvitega modela za določanje imunosupresivnega delovanja spojin. Najprej smo ocenili citotoksično delovanje izbranih spojin s testom redukcije resazurina. Pri testiranih koncentracijah smo kot citotoksične spojine identificirali dasatinib pri koncentracijah, višjih od 1 μM, imatinib pri 50 μM koncentraciji in torin 1 pri koncentracijah, višjih od 100 nM. V nadaljevanju smo celice kokulture izpostavili 10 μM in 100 nM koncentraciji izbranih spojin. Najvišja koncentracija, pri kateri večina spojin ne deluje citotoksično na celice kokulture, je namreč 10 μM, 100 nM koncentracija pa predstavlja koncentracije, ki jih testirane spojine dosegajo pri in vivo pogojih. Celice smo nato aktivirali s kombinacijo aktivatorjev in z ELISA testom določili koncentracijo izločenih citokinov IL-2, IL-8 in TNF-α. Pri 10 μM koncentraciji smo uspeli dokazati imunosupresivno delovanje spojin dasatinib, imatinib, tofacitinib, idelalizib, mirdametinib in torin 1. Pri 100 nM koncentraciji pa smo uspeli dokazati imunosupresivno delovanje spojin tofacitinib, mirdametinib, torin 1 in dasatinib. Z razvitim modelom nismo uspeli dokazati imunosupresivnega delovanja spojin apremilast, bukladezin in sulfasalazin. Zaključili smo, da model ni ustrezen za ocenjevanje spojin, ki delujejo kot inhibitorji fosfodiesteraz, in spojin, ki inhibirajo izločanje citokinov IL-2 in TNF-α iz celic THP-1. Za oceno imunosupresivnega delovanja spojin bi bil najprimernejši citokin IL-8, saj omogoča dokazovanje imunosupresije, poleg tega pa ga izločajo oboje celice kokulture, medtem ko IL-2 in TNF-α izločajo le celice Jurkat, zato ne dobimo popolnega vpogleda v potencialno imunosupresivno delovanje spojine. V prihodnje bi bilo smiselno delovanje modela oceniti še z uporabo spojin z mehanizmi delovanja, ki doslej niso bili preverjeni, in v model vključiti še druge vrste imunskih celic, da bi model tako še bolje odražal sestavo polne krvi.20242024-08-23 08:45:03Magistrsko delo/naloga160209VisID: 106611sl