Vpliv motene sinteze holesterola v jetrnih celicah na signalizacijo prek jedrnega receptorja RORC in na cirkadiano uroSkubic, Cene (Avtor) Rozman, Damjana (Mentor) holesterolsteroliRORCHepG2CRISPR-Cas9sinteza holesterolacirkadiana uraCYP51A1DHCR24SC5DHSD17B7Holesterol je esencialna molekula, glavni sterol v vseh celicah sesalcev in eden od ključnih komponent celičnih membran. Določa strukturne in funkcionalne parametre membran in je tudi sestavni del lipidnih raftov. Je predhodnik steroidnih hormonov, žolčnih kislin in oksidiranih oblik holesterola. Sinteza holesterola je proces, aktiven v vseh tkivih, najbolj v jetrih in je natančno uravnan na več ravneh, motnje v sintezi pa vodijo v številna patološka stanja. Vključuje več kot 20 reakcij, pri katerih sodelujejo številni encimi. V poskvalenskem delu se sinteza začne z lanosterolom, iz katerega nato v vsaj 11 encimskih reakcijah nastane holesterol. Po pretvorbi lanosterola se sinteza razdeli na dve predpostavljeni sintezni poti; Bloch-ovo in Kandutsch-Russell-ovo, v katerih je vsaj 19 različnih sterolnih molekul. Znano je, da ima imajo steroli tudi druge funkcije, ki niso neposredno povezane s sintezo holesterola. Intermediati iz sinteze holesterola lahko delujejo kot ligandi jedrnega receptorja RORC, ki uravnava transkripcijo tarčnih genov z vezavo na DNA promotorska zaporedja RORE. Ni še pojasnjeno, kateri steroli so fiziološki ligandi RORC v različnih tipih celic in kako preko sterolov aktivirana signalizacija RORC vpliva na cirkadiano uro v jetrih in posledično na presnovne procese, povezane s cirkadiano uro. Cirkadiana ura je transkripcijsko-translacijski mehanizem, s katerim je uravnan 24 urni ritem v organizmih. Na genetski ravni so za to zadolženi osrednji geni in proteini cirkadiane ure, CLOCK, BMAL1, PER in CRY. Znano je, da se cirkadiano izražanje genov na sekundarni ravni uravnava tudi preko transkripcijskih faktorjev ROR, ki de/aktivirajo prepisovanje cirkadianih genov preko vezave na RORE. V doktorski nalogi smo pozornost posvetili sterolom, ki se v sintezni poti holesterola nahajajo med lanosterolom in holesterolom. Cilj je bil opredeliti njihovo vlogo v različnih celičnih signalizacijah in tudi kot možnih ligandov jedrnega receptorja RORC v jetrnih celicah. S tem namenom smo pripravili celične linije HepG2 z izbitimi geni iz sinteze holesterola in posledično obogatenimi določenimi steroli. Cilj je bil tudi vzpostaviti metodologijo za detekcijo in kvantifikacijo sterolov. S pomočjo metode CRISPR-Cas9 smo spremenili zaporedje DNA v tarčnih genih CYP51A1, DHCR24, SC5D in HSD17B7, s čimer smo prekinili sintezo holesterola na različnih stopnjah. Z novo razvito metodo LC-MS, ki omogoča opredelitev in kvantifikacijo 11 nepolarnih sterolnih intermediatov iz sinteze holesterola, smo pokazali, da nobeden od tarčnih encimov ni več funkcionalen. Steroli po encimskem koraku, ki je bil izničen, niso bili več prisotni v celicah, medtem ko so se prekurzorski steroli nabirali v visokih koncentracijah. Kopičenje sterolov je vplivalo na diferenčno izražanje genov, pri čemer se je večina poti spremenila v samo eni celični liniji z izbitim genom. To nakazuje na specifične mehanizme, v katere so vključeni posamezni steroli. Analiza obogatenih metabolnih poti, genov in transktipcijskih faktorjev je pokazala številne statistično značilno spremenjene poti, med katerimi pa ni bilo RORC, niti poti, v katere je RORC vpleten. Meritev genov pod kontrolo RORC z RT-qPCR in z mikromrežami ni pokazala pričakovanih razlik v izražanju tarčnih genov v HepG2 celičnem modelu. Po prekomernem izražanju RORC v celičnih linijah in imunoprecipitaciji frakcije RORC sterolov, ki bi bili specifično vezani na RORC, nismo uspeli opredeliti. Predhodne in vitro študije, ki so pokazale, da steroli lahko aktivirajo signalizacijo RORC, so bile izvedene na transkripcijski različici RORC2, v jetrih in tudi celicah HepG2, pa se izraža RORC1, pri kateri predhodnih rezultatov nismo potrdili. Razlog za to je lahko spremenjena aminokislinska razlika med obema različicama RORC. Naši rezultati kažejo na pomembnost upoštevanja transkripcijskih variant in tkivne specifičnosti pri študijah signalizacije preko RORC. Pokazali pa smo vlogo sterolov v signalizaciji NFKB/WNT preko proteina LEF1. Pokazali smo, da zgodnji steroli, kot je 24,25-dihidrolanosterol pospešujejo proliferacijo celic in spremembe v celičnem ciklu. Študije cirkadianega izražanja genov v celicah HepG2 so pokazale, da imajo te celice nizko osnovno oscilacijo izražanja genov. Opredelili smo spremembe v izražanju nekaterih genov osrednje cirkadiane ure v celicah z izbitimi geni sinteze holesterola v primerjavi s kontrolnimi celicami. Rezultati kažejo spremenjeno oscilacijo genov BMAL1 in CRY1 in zamik faze gena PER2, česar pa ne moremo pripisati spremenjeni signalizaciji RORC. Najverjetneje gre za vpliv drugih signalnih poti, kot sta WNT in NF-KB, ter spremembe v celičnem ciklu. Naše ugotovitve kažejo, da steroli iz sinteze holesterola nadzirajo različne signalne poti v HepG2 in da le zgodnji steroli spodbujajo celično proliferacijo.20232024-07-18 08:46:09Doktorsko delo/naloga159687VisID: 26389sl