Razvoj sistema za nadzorovano celično razgradnjo proteinov z uporabo sesalskih ubikvitin ligazVerbič, Anže (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) ubikvitinacijaproteasomE3 ligazadegronSCF-Skp2sintezna biologijaCDC34Zunanji nadzor nad sintezno-biološkimi sistemi ali na splošno nad celičnimi procesi lahko izvajamo na različnih ravneh – na nivoju transkripcije, translacije, proteinske funkcije ali stabilnosti proteinov. V zadnjih letih se povečuje zanimanje za uporabo proteinske razgradnje za nadzor stabilnosti proteinov v sintezno-biološke, raziskovalne ter tudi terapevtske namene. Za razvoj sistemov razgradnje tarčnih proteinov potrebujemo raznolike pristope, s katerimi omogočimo interakcijo tarčnih proteinov z endogenimi sistemi razgradnje proteinov. Glavna pot razgradnje celičnih proteinov je preko ubikvitin-proteasomalnega sistema, kjer so glavni igralec prepoznave in označevanja proteinov za razgradnjo ubikvitin ligaze oz. E3 ligazni kompleksi. Namen tega dela je bil preučiti možnost uporabe različnih podenot E3 ligaz kot degronov za razgradnjo celičnih proteinov, raziskati njihove lastnosti, razviti načine za regulacijo njihove aktivnosti in testirati njihovo uporabnost za razgradnjo različnih substratov. Pri načrtovanju tako zamišljenih degronov smo izhajali iz strukturnih podatkov SCF-Skp2 E3 ligaznega kompleksa, sestavljenega iz Skp2, Skp1, Cul1 in Rbx1 proteinov, hkrati pa smo preučili tudi uporabo CDC34 E2 proteina kot degrona. Pokazali smo, da lahko vse podenote SCF-Skp2 E3 ligaze uporabimo kot načrtovane degrone, ki omogočajo učinkovito razgradnjo proteinskih substratov, ter da lahko z obzirom na njihove interakcije z ostalimi proteini izboljšamo njihovo učinkovitost razgradnje. Razgradnja substratov v fuziji z degroni se je izkazala za zelo učinkovito, primerljivo z najbolje delujočimi degroni v literaturi. Vrednost sintezno-biološkega orodja je odvisna od njegove modularnosti, prilagodljivosti in robustnosti delovanja. Opisali smo več faktorjev, ki vplivajo na učinkovitost razgradnje z načrtovanimi degroni, ki jih mora raziskovalec upoštevati pri implementaciji v lastno okolje. Pokazali smo, da lahko učinkovitost razgradnje moduliramo s spreminjanjem afinitete med substratom in degronom in vplivanjem na interakcijsko površino degrona. Razvili smo več načinov nadzora nad aktivacijo ali represijo razgradnje, ki temeljijo na uporabi virusnih proteaz in kemično inducibilne dimerizacije. Da bi omogočili razgradnjo substratov v različnih celičnih razdelkih smo se poslužili veriženja degronov. Verižen degron, sestavljen iz dveh povezanih degronov, se je izkazal za zelo robustnega, saj je omogočal razgradnjo citosolnih, jedrnih in membranskih proteinov, s hitro kinetiko in dobro aktivnostjo v različnih celičnih linijah. Naši rezultati predstavljajo uvid v uporabo podenot naravnih sistemov razgradnje proteinov v sistemih upravljanja z izražanjem tarčnih proteinov in v strategije modulacije ter pristope k nadzoru njihove aktivnosti.20242024-07-10 07:15:35Doktorsko delo/naloga159405VisID: 26376sl