Priprava skrajšanih oblik proteina FHL2 in analiza njihovih interakcij z β-kateninomGašperšič, Laura (Avtor) Gaber, Aljaž (Mentor) proteinske interakcijeFHL2β‑kateninOmniSECNepravilnosti v delovanju in regulaciji signalnih poti v celicah prispevajo k razvoju bolezenskih stanj in rakavih obolenj. Med že znanimi potmi, ki močno vplivajo na razvoj tumorjev, je tudi signalna pot Wnt, pri kateri kot ključni protein sodeluje β‑katenin. Z vezavo s transkripcijskim faktorjem Lef-1 spodbuja proliferacijo celic in napredovanje celičnega cikla. Do aktivacije izražanja podobnih genov pa lahko pride tudi ob tvorbi kompleksa EpIC–FHL2–β‑katenin–Lef-1. Nastanek kompleksa se začne v citosolu po regulirani znotrajmembranski proteolizi proteina EpCAM, pri čemer nastane konstrukt EpIC. Le ta interagira z β‑kateninom in FHL2, v jedru pa se v kompleks veže še Lef-1. Interakcija med proteini tega kompleksa je že potrjena, so pa podatki pomanjkljivi in zahtevajo dodatne analize. V okviru magistrskega dela smo želeli natančneje okarakterizirati domene, ki sodelujejo pri interakcijah med omenjenimi proteini, in sicer z uporabo dveh različnih metod, ki analizirata interakcije med proteini (test zadrževanja in z analizo statičnega sipanja svetlobe z napravo OmniSEC). Pri delu smo najprej pripravili vse ustrezne vektorje za izražanje fluorescenčno označenih ter neoznačenih proteinov. Pri izražanju v bakterijskih celicah E. coli in čiščenju nekaterih rekombinantnih proteinov smo naleteli na težave, poleg tega pa pri interakciji med fluorescenčno označenimi proteini pride do drugačne stehiometrije udeleženih proteinov kot pri interakciji med neoznačenimi proteini, zato analiz s testom zadrževanja nismo izvedi. Za analize z napravo OmniSEC smo izrazili in očistili tako celotne kot skrajšane oblike proteinov FHL2 in β‑katenina. Pri tem smo pri nekaterih konstruktih opazili visoko stopnjo obarjanja, zato jih zaradi občutljivosti metode za končne analize z napravo OmniSEC nismo uporabili. Na podlagi pridobljenih rezultatov lahko sklepamo, da je za interakcijo med FHL2 in β‑kateninom pomembna tretja domena proteina FHL2 (LIM3), stabilno interakcijo pa tvori le celoten protein FHL2. Vzorec obarjanja skrajšanih konstruktov proteina FHL2 nakazuje možnost nastanka intramolekularne interakcije med domenama LIM0 in LIM2, ki preprečuje intermolekularno interakcijo med domenama LIM1 in LIM2 med sosednjimi molekulami. Ob odsotnosti domene LIM0 tako lahko pride do dimerizacije in obarjanja skrajšanih konstruktov. Dobljeni rezultati predstavljajo vpogled v interakcije med proteinom FHL2 in β‑kateninom, ki sta del kompleksa EpIC–FHL2–β‑katenin–Lef-1, vendar so za natančno poznavanje interakcij potrebne še dodatne raziskave. Magistrska naloga služi kot podlaga za izražanje in čiščenje uporabljenih proteinskih konstruktov, pri čemer pa je potrebna optimizacija pogojev čiščenja (uporaba drugačnih pufrov). Možnost izvedbe testa zadrževanja bi doprinesla pomembne informacije o interakcijah med proteini kompleksa in možnosti za boljše načrtovanje zdravil, ki bi regulirala delovanje tega kompleksa.20242024-07-05 11:45:00Magistrsko delo/naloga159303VisID: 22653COBISS_ID: 203511555sl