Vrednotenje fotofizikalnih lastnosti izbranih fluorescenčnih sond in njihove primernosti za označevanje lipidnih kapljicPezdirec, Ana (Avtor) Pajk, Stane (Mentor) Kokot, Hana (Komentor) fluorescenčne sondemolarni ekstinkcijski koeficientkvantni izkoristekSTED mikroskopijalipidne kapljiceFluorescenčna mikroskopija je ena od podvrst optične mikroskopije, kjer za proučevanje vzorca uporabljamo fluorescenco ali fosforescenco. Gre za nepogrešljivo metodo v celični biologiji, pri kateri specifične organele oz. molekule označimo s fluorescenčnimi barvili, katerih fluorescenco zaradi specifične emisije učinkovito ločimo od signala ozadja. Ta barvila imenujemo fluorofori. To so molekule, ki pri določeni valovni dolžini absorbirajo svetlobo ter preidejo v višje energijsko stanje, ko se vrnejo v osnovno stanje, pa oddajo foton z daljšo valovno dolžino. Najbolj poznano področje njihove uporabe je označevanje celičnih organelov. Pri izbiri primernega fluorofora za fluorescenčno mikroskopijo moramo upoštevati nekatere njegove ključne lastnosti, kot so ekscitacijski in emisijski spekter, molarni ekstinkcijski koeficient, kvantni izkoristek, učinkovitost in selektivnost označevanja želenih celičnih struktur, kemijska stabilnost in fotostabilnost. Pomanjkljivost klasične fluorescenčne mikroskopije je slaba ločljivost, ki pa so jo znanstveniki uspešno rešili z razvojem super-ločljivostnih metod. Ena izmed le-teh je mikroskopija z vzbujenim praznjenjem emisije (STED, angl. stimulated emission depletion), ki je bila prvič omenjena leta 1994. Največkrat jo uporabljamo za proučevanje objektov, manjših od uklonske limite (< 200 nm). Za namen te magistrske naloge smo analizirali 5 na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani, sintetiziranih fluorescenčnih sond. V prvem delu, ki je potekal na Fakulteti za farmacijo, smo vrednotili fotofizikalne lastnosti fluorescenčnih sond. Na UV-VIS ter fluorescenčnem spektrometru smo jim pomerili absorpcijski (ekscitacijski) ter emisijski spekter ter izračunali molarni ekstinkcijski koeficient in kvantni izkoristek. V drugem delu smo nato ugotavljali primernost posamezne fluorescenčne sonde za označevanje lipidnih kapljic celic LA-4 z metodama konfokalne fluorescenčne mikroskopije in STED mikroskopije. Zanimalo nas je, ali je sonda primerna za STED mikroskopijo, katere celične organele še označuje, kakšna je njena fotostabilnost in potencialna citotoksičnost. Ta del je potekal na Institutu Jožef Stefan v Ljubljani. Ugotovili smo, da sonde niso najbolj primerne za STED mikroskopijo, saj smo z njo pridobili posnetke z zgolj malo izboljšano ločljivostjo. Nekatere sonde so označile lipidne kapljice in so bile spektralno občutljive, nekatere pa so označile druge notranje celične strukture. Ena sonda je imela citotoksične lastnosti. Vse so bile izjemno fotostabilne, zaradi česar bi jih lahko uporabili v kombinaciji z drugimi sondami, ki pa so primerne za STED mikroskopijo.20242024-07-04 08:45:15Magistrsko delo/naloga159252VisID: 105151sl