Vzpostavitev presejalnega testa za preverjanje uspešnosti vgradnje nestandardnih aminokislin v porotvorne toksineAgnič, Anamarija (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) GFPnanoporanestandardne aminokislineporotvorni toksinipresejalni testBionanotehnološki pristop za zaznavanje analitov na osnovi njihove prepustnosti skozi proteinske nanopore je napredno bioanalizno orodje, katerega zmogljivost in kakovost sta v veliki meri odvisna od lastnosti osrednje komponente senzorskega sistema – nanopore. Z vgrajevanjem nestandardnih aminokislin na mesta v notranjosti kanala lahko nanoporo na različne načine funkcionaliziramo, z na novo pridobljenimi lastnostmi pa razširimo spekter določljivih analitov. Zaradi nastajanja skrajšanih produktov tarčnega proteina in obremenitve gostiteljskega organizma je postopek vgrajevanja nestandardnih aminokislin v rekombinantne proteine časovno in cenovno zahteven. V okviru magistrskega dela smo vzpostavili presejalni test, s katerim je sistematično in z uporabo majhnih količin reagentov med variantami porotvornih toksinov, ki nestandardni aminokislinski ostanek vsebujejo na različnih položajih v polipeptidni verigi, mogoče identificirati tiste, ki se proizvedejo v funkcionalni obliki in so primerne za rabo v biosenzorjih. Kot model smo uporabili porotvorna toksina lizenin in aktinoporin M. Z metodami molekulskega kloniranja smo pripravili fuzijska DNA zaporedja njunih variant s C-končnim zapisom za zeleni fluorescenčni protein (GFP). V prvi stopnji izvedbe presejalnega testa smo na mikrotitrski plošči spremljali fluorescenco različic v E. coli nastajajočega fuzijskega porotvornega toksina in vivo. V drugi stopnji presejalnega testa pa smo sposobnost tvorjenja por proizvedenih variant porotvornega toksina ovrednotili s testom hemolitične aktivnosti. Ugotovili smo, da se glede na tip nestandardne aminokisline, kot tudi mesto vgradnje njenega ostanka, različice porotvornih toksinov proizvedejo različno uspešno. Različno uspešne so tudi po sposobnosti tvorjenja por. S pripravo, izolacijo in biofizikalno karakterizacijo nanopor modelnih porotvornih toksinov divjega tipa smo dokazali, da so pripravljena fuzijska DNA-zaporedja primerna za proizvodnjo monomerov porotvornih toksinov in pripravo nanopor v večjem merilu. Presejalni test za preverjanje uspešnosti vgradnje nestandardnih aminokislin je visokozmogljiva metoda, uporabna za testiranje učinkovitosti izražanja rekombinantnih porotvornih toksinov v majhnih volumnih kulture in za optimizacijo pogojev za vgradnjo nestandardnih aminokislin v katerikoli porotvorni toksin.20242024-07-02 12:15:53Magistrsko delo/naloga159165VisID: 23061COBISS_ID: 201492227sl