Termodinamika zvijanja α-vijačnic: od modelnih peptidov do intrinzično neurejenih proteinovZavrtanik, Uroš (Avtor) Hadži, San (Mentor) -V pričujočem doktorskem delu so prikazani rezultati raziskav termodinamike zvijanja α-vijačnice v različnih (bio)molekularnih sistemih. V prvem delu smo se posvetili alaninskim peptidom, ki v vodni raztopini tvorijo α-vijačnico. Sistem smo preučili z dvema eksperimentalnima tehnikama – diferenčno dinamično kalorimetrijo (DSC) in CD spektroskopijo. Z DSC smo natančno izmerili temperaturno odvisnost toplotnih kapacitet alaninskih peptidov različnih dolžin. Z uporabo statistično-termodinamskega Lifson-Roigovega modela, ki opisuje prehod α-vijačnica-naključni klobčič, smo uspešno opisali eksperimentalne podatke ter določili temeljne parametre zvitja alaninske α-vijačnice z visoko zanesljivostjo. Določitev nukleacijske konstante je sploh prva kalorimetrična določitev tega osnovnega parametra za prehod α-vijačnica-naključni klobčič. Rezultati spektroskopske raziskave termične denaturacije alaninskih peptidov v veliki meri potrjujejo izsledke kalorimetrične študije. V raziskavi smo pokazali, da trenutno uveljavljena metoda analize CD spektroskopskega signala α-vijačnih peptidov podceni delež aminokislinskih ostankov v α-vijačnici (heličnost). Zato smo razvili nov računski postopek (model) za obravnavo CD signala α-vijačnih peptidov, ki omogoča boljši opis spreminjanja heličnosti med razvijanjem peptida. Modelska analiza iz eksperimentalnih podatkov izlušči več informacij, modelni parametri pa so določeni z večjo zanesljivostjo. Računalniški program za oceno heličnosti peptida je prosto dostopen na GitHub-u (https://github.com/rubiscoo/Dichroic-CD-model). V drugem delu doktorskega dela smo preučevali α-vijačnice v kontekstu intrinzično neurejenih proteinov. Z bioinformatskimi metodami smo preučevali tako imenovane vijačne vezavne motive (ang. helical binding motifs). Te najdemo v številnih intrinzično neurejnih proteinih in igrajo pomembno vlogo pri vezanju na tarčne proteine. Z analizo aminokislinskih zaporedji smo uspeli razložiti obstoj rezidualnih α-vijačnih struktur (ang. residual helical structure) v nevezanih stanjih intrinzično neurejenih proteinov. Pokazali smo na pomembno vlogo aminokislinskih ostankov z večjo težnjo po tvorbi α-vijačnice. Še posebej izrazita in zanimiva je velika pojavnost levcinskega aminokislinskega ostanka. Ta igra v vijačnih motivih dvojno vlogo, saj poleg stabilizacije rezidualne α-vijačne strukture pomembno prispeva k močnim interakcijam (ang. hotspot) s tarčnimi proteini. Dvojno vlogo levcina v vezavnih motivih smo potrdili tudi eksperimentalno s spektroskopskimi (CD) in kalorimetričnimi eksperimenti (ITC). S kombinacijo slednjih eksperimentalnih tehnik smo preučili tudi interakcijo toksina HigB2 in antitoksina HigA2, ki se ob vezanju na globularni toksin uredi v α-vijačnico. Z uporabo Lifson-Roigovega modela in disekcije termodinamskih parametrov asociacije smo uspešno razločili termodinamske prispevke vezanja in zvitja intrinzično neurejenega proteina. Tako smo pojasnili termodinamske vzroke visoke afinitete (K$_D$ = 3pM) intrinzično neurejenega proteina za asociacijo z globularno tarčo. Ta je primerljiva najvišjim afinitetam asociacije globularnih proteinov. Analiza omogoča tudi določitev termodinamskih prispevkov zvitja α-vijačnice za zaporedja z nizko težnjo po tvorbi α-vijačnice, česar drugi pristopi ne omogočajo. 20242024-07-01 15:20:00Doktorsko delo/naloga159137VisID: 20643COBISS_ID: 203261443sl