Načrtovane nanostrukture iz več polipeptidnih verigSnoj, Jaka (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) obvite vijačniceproteinski origamicepljenje in spajanje z inteinitrimerizacijske domeneveč-verižne struktureproteinske nitiproteinske mrežeV naravi najdemo mnoge kompleksne biološke strukture in materiale, ki so zmožni samo-sestavljanja in so zgled za pripravo novih načrtovanih nanomaterialov z možnostmi za uporabo na različnih področjih našega življenja. Eden od pristopov sintezne biologije, s katerim lahko načrtujemo molekulske interakcije na nanometerskem nivoju, je de novo načrtovanje proteinskih gradnikov, ki temelji na zaporedju peptidnih segmentov (?-vijačnic) v polipeptidni verigi, ki kot ortogonalni pari tvorijo obvite vijačnice (OV) in s tem omogočajo samo-sestavljanje polipeptidne verige. Naša skupina je demonstrirala uspešno načrtovanje stabilnih kletk z različno geometrijo (tetraeder, piramida, bipiramida) iz ene same polipeptidne verige, kjer so robove predstavljale OV ortogonalnih parov peptidnih segmentov. Načrtovanje večjih in kompleksnejših struktur z namenom raznovrstne uporabe, kot je na primer enkapsulacija molekul, zahteva povezovanje več verig, kar predstavlja izzive in potrebuje pristop z drugačno strategijo. V tem doktorskem delu smo razširili uporabo peptidnih segmentov, ki tvorijo OV, na načrtovanje in pripravo nanostruktur, ki se sestavijo iz več polipeptidnih verig. Tipi več-verižnih nanostruktur, ki smo jih poskusili načrtovati, so vključevali diskretne kletke pravilnih (tetraeder, trigonalna bipiramida) in asimetričnih oblik (konkavni oktaeder) ter večje nanostrukture na osnovi periodičnih ponovitev (proteinska nanovlakna in proteinske nanomreže). Sestavljanje nanostruktur v predviden tip smo poskusili usmerjati preko preorganizacije proteinskih komponent z različnimi strategijami, kot so ciklizacija verig z inteinskim cepljenjem in spajanjem, vpeljava fleksibilnih ali rigidnih povezovalcev in vpeljava trimerizacijskih domen ter znotraj-verižnih povezav OV. Prvi od treh konceptov, ki smo jih razvijali tekom doktorata, je bil načrtovanje mrež na podlagi himernih proteinov s segmenti za tvorbo med-verižnih OV, katerih planarno orientacijo povezovanja naj bi narekovale trimerizacijske domene na himernih proteinih. Izkazalo se je, da uporabljeni trimerizacijski domeni foldon in kolagenska domena nista nudili dovolj rigidne in planarne orientacije za tvorbo OV in smo namesto periodično ponavljajočih se mrež sestavili diskretne 6-merne strukture. Naslednji koncept, ki smo ga preizkusili, je bil samo-sestavljanje nanovlakna iz himernih proteinov iz dveh zaporednih segmentov za tvorbo OV in vmesnega povezovalca. Uporabili smo dva različna himerna proteina s komplementarnimi segmenti za tvorbo OV, kar naj bi omogočilo njihovo periodočno zlaganje enega za drugim v dveh vzporednih verigah. Strategija je predvidevala tudi dodatno stabilizacijo teh niti s tvorbo kovalentnih vezi med posameznimi enotami, kar smo želeli doseči z uporabo razcepljenih inteinov, ki so sposobni samo-izrezovanja in spajanja ostankov. S tem konceptom smo testirali različne ortogonalne pare razcepljenih inteinov in optimizirali pogoje za uspešno reakcijo rezanja in spajanja v načinu cis, kar smo uporabili v dizajnih, ki so vsebovali ciklizirane proteine. Tretji koncept je predvideval načrtovanje več-verižnih proteinskih struktur na osnovi cikliziranih peptidnih verig. Polipeptide iz treh ali šestih segmentov za tvorbo OV in povezovalcev smo ciklizirali v bakterijskih celicah z uporabo razcepljenega inteina, ki je sprožil ciklizacijo s cepljenjem in spajanjem N in C terminalnega konca himernega proteina. Na ta način smo dobili himerne proteine preorganizirane v stabilni obliki trikotnikov ali rombov, ki so imele definirane notranje kote med segmenti, kar je omogočalo večjo predvidljivost za načrtovanje več-verižnih struktur. Iz cikliziranih trikotnih himernih proteinov, kjer smo variirali kofiguracijo segmentov za tvorbo OV, smo želeli sestaviti različne strukture, kot so 8-komponentni oktaeder, 12 komponentna heksagonalna bipiramida in nanomreže. Naslednji dizajn je predvideval nastanek večjih pravilnih struktur iz trikotnikov in kratkega linearnega peptida sestavljenega iz dveh segmentov za tvorbo OV in vmesnega povezovalca. Vsi dizajni, ki so vsebovali trikotnike, so bili neuspešni, ker se je izkazalo, da ciklizirani trikotniki niso bili zmožni tvoriti interakcijskih površin v obliki OV z vsemi svojimi tremi stranicami naenkrat. Ciklizirani rombi, ki so vsebovali eno znotraj-verižno OV in 4 proste segmente za tvorbo OV, so se izkazali za uspešne podenote za tvorbo več-verižnih nanostruktur. Pokazali smo, da so ciklizirani rombi potrebni za uspešno sestavljanje struktur, kot sta dvoverižni tetraeder in tro-verižni konkavni oktaeder. V doktorskem delu smo uspešno razširili uporabo peptidnih segmentov, ki tvorijo OV, na načrtovanje nanostruktur, sestavljenih iz več polipeptidnih verig. Z uporabo trimerizacijskih domen smo pripravili diskretne, več-verižne strukture, za načrtovanje periodično ponavljajočih se nanomrež pa sta se trimerizacijski domeni foldon in kolagenska domena izkazali kot neustrezni. Poskus načrtovanja nanovlaken s kratkimi linearnimi peptidi in inteinsko stabilizacijo nam je služil predvsem za optimizacijo inteinske reakcije, kar smo aplicirali pri načrtovanju več-verižnih struktur iz cikliziranih himernih proteinov. S pomočjo razcepljenih inteinov smo ciklizirali peptidne verige in jih tako preorganizirali v trikotnike ali rombe. Slednji so se izkazali za ustrezne podenote za uspešno sestavljanje več-verižnih struktur, kot so dvo-verižni tetraeder, tro-verižni konkavni oktaeder in trigonalna bipiramida.20242024-06-21 07:15:08Doktorsko delo/naloga158806VisID: 26351sl