Stabilizacija in strukturna karakterizacija proteinov iz obvitih vijačnicSatler, Tadej (Avtor) Gradišar, Helena (Mentor) Jerala, Roman (Komentor) obvite vijačniceproteinski origamikristalna strukturaPodročje oblikovanja proteinov de novo omogoča pripravo novih proteinskih zvitji, ki niso bila nikoli evolucijsko vzorčena. Kljub velikemu napredku na tem področju je še vedno potrebno veliko eksperimentalnega dela, da uspešno pripravimo protein z želeno strukturo in funkcijo. Alternativna strategija načrtovanja proteinov temelji na gradnji proteinov iz modularnih gradnikov, za katere dobro poznamo razmerje med zaporedjem in strukturo. Proteinski origami lahko načrtujemo na osnovi modularnih gradnikov iz obvitih vijačnic. Obliko poliedra definiramo s topološko razporeditvijo paralelnih in/ali antiparalelnih parov obvitih vijačnic, kjer so posamezni peptidni segmenti, glede na osnovna matematična pravila, v natančno določenem vrstnem redu zaporedno nanizani v polipeptidni verigi. Čeprav se je izkazalo, da je strategija načrtovanja proteinskih origamijev robusten pristop k ustvarjanju topološko raznolikih poliedrov, pa zaradi majhnosti in fleksibilnosti teh proteinskih struktur še nismo imeli strukturnih podatkov visoke ločljivosti. V doktorskem delu smo z različnimi pristopi naslovili problem strukturne karakterizacije proteinskih origamijev in uspeli določiti kristalno strukturo trikotnika iz obvitih vijačnic v visoki ločljivosti. Pripravili smo stabilizirane proteine iz obvitih vijačnic v obliki trikotnika, pri čemer smo uporabili stabilizirane variante peptidnih segmentov, hkrati pa smo zmanjšali fleksibilnost proteinskega zvitja z uporabo krajših povezovalnih peptidov, ki povezujejo peptidne segmente. Pokazali smo, da lahko proteine dodatno stabiliziramo tudi s kovalentnim povezovanjem N- in C-koncev, kar smo dosegli tako z uporabo razcepljenih inteinov kot tudi z encimom tirozinazo. Uspešno smo pripravili različne komplekse proteinov iz obvitih vijačnic z nanotelesi in ogrodjem legotelesa, z namenom spodbuditi kristalizacijo proteinov ali povečati velikost in kontrast proteina za strukturno analizo na krio-elektronskem mikroskopu. Za pripravo kompleksov smo uporabili tako znana nanotelesa, ki vežejo obvite vijačnice, kot tudi nanotelesa, katerim smo transplantirali epitop na motiv obvite vijačnice. Pripravili smo modularen sistem za transplantacijo epitopa nanotelesa Nb49 in intratelesa Ib3, ter s pripravo večih različnih proteinskih konstruktov potrdili njuno učinkovitost. Z uporabo stabilnejših peptidnih segmentov, krajših povezovalnih zaporedij ter vključitvijo naravnega homodimernega peptidnega para GCN2, smo pripravili konstrukt trikotnika iz obvitih vijačnic - TRI-4SHbGCN, ki je uspešno kristaliziral in smo mu določili kristalno strukturo. Ta je potrdila načrtovano trikotno obliko, ki ima osrednjo votlino. Protein ima topologijo trolistnega vozla in je dodatno stabiliziran z interakcijami med peptidnimi segmenti v ogljiščih trikotne strukture. Ortogonalni peptidni segmenti se povezujejo s svojim parom ter ohranjajo celovitost strukture obvite vijačnice tudi v sklopu proteinskega origamija, hkrati pa opazimo primerljivo pakiranje homolognih aminokislinskih ostankov hidrofobne sredice. Kristalna struktura prinaša nov vpogled v razumevanje molekularnih mehanizmov zvijanja in stabilnosti trikotnikov iz obvitih vijačnic.20242024-06-16 07:15:16Doktorsko delo/naloga158581VisID: 26347sl