Učinki elektrokemoterapije in ionizirajočega sevanja na imunološko pomembne spremembe v tumorskih celicahKešar, Urša (Avtor) Strojan, Primož (Mentor) Elektrokemoterapijaionizirajoče sevanjecisplatinoksaliplatinbleomicinimunogena celična smrtATPHMGB1kalretikulinMHC IMHC IIPD-L1CD40Znanstveno izhodišče: Za zdravljenje tumorjev se uporabljajo različne ablativne terapije, med njimi radioterapija (RT) in elektrokemoterapija (EKT). Pri RT tumorske celice umirajo zaradi učinkov ionizirajočega sevanja (IR), pri EKT, ki združuje citostatike in elektroporacijo tkiva, pa tumorske celice umirajo zaradi citotoksičnosti zdravila na mestu aplikacije električnih pulzov. Obe terapiji s svojim delovanjem povzročata poškodbe dednega materiala tumorskih celic (DNA), s čimer onemogočata njihovo nadaljnjo delitev, in sprožita aktivacijo imunskega sistema ter povzročita različne vrste celične smrti. Mednje uvrščamo imunogeno celično smrt (ICD), apoptozo, nekrozo in avtofagijo. ICD predstavlja način umiranja celic, kjer je spodbujen pridobljen imunski odziv proti neoantigenom. Molekule, vpletene v ICD, so: na celični membrani izpostavljen kalretikulin (CRT), izven celice sproščen protein HMGB1 ter adenozin trifosfat (ATP). Poleg tega k imunskemu (ne)odzivu prispevajo tudi druge, imunološko pomembne spremembe v tumorskih celicah, ki vključujejo molekule MHC I in II ter PD-L1 in CD40. Dokazano je, da lahko RT izzove aktivacijo gostiteljevega imunskega sistema in sproži ICD, kar se odraža v imunskem spominu ter včasih sistemskih protitumorskih učinkih, ni pa znano, katere doze in režimi najučinkoviteje aktivirajo imunski sistem pri različnih vrstah tumorskih modelov. Učinkovitost EKT je sicer odvisna od imunogenosti tumorjev in njihove intrinzične občutljivosti na citostatike. Za optimizacijo aktivacije imunskega odziva z EKT je zato treba določiti, kateri citostatik, koncentracija in časovni okvir po terapiji izzovejo največ imunološko pomembnih sprememb v tumorskih celicah. Namen doktorske naloge je bil tako ugotoviti, kateri citostatik, ki se uporablja v EKT, ter v kakšni koncentraciji in v katerem časovnem okviru po terapiji v največji meri izzove imunološko pomembne spremembe v tumorskih celicah in vitro ter te primerjati s spremembami po IR. Metode: V prvem delovnem sklopu doktorske naloge smo določili občutljivost mišjih tumorskih celičnih linij B16-F10 (melanom), 4T1 (karcinom dojke) in CT26 (rak debelega črevesa) in vitro na EKT z različnimi citostatiki in na IR. Najprej smo določili elektropermeabilnost celičnih linij, tako da smo suspenzijskim celicam dodali propidijev jodid, nato pa to suspenzijo napipetirali med dve ploščati elektrodi (z razdaljo med elektrodama 2,4 mm) ter jim dovedli električne pulze (8 pulzov, 100 µs, 1 Hz), ki smo jim spreminjali napetost na razdalji. V nadaljevanju smo določili preživetje celičnih linij po EKT s cisplatinom (CDDP), oksaliplatinom (OXA) in bleomicinom (BLM) in IR s testom klonogenosti. Z generatorjem električnih pulzov Jouan GHT beta smo celicam dovedli električne pulze, ki se uporabljajo pri EKT v kliniki (8 pulzov, 1300 V/cm, 100 µs, 1 Hz), nato pa celice v različnem številu nasadili na plošče. Za določitev radioobčutljivosti smo celice v različnem številu najprej nasadili na plošče in jih po treh urah obsevali z različnimi dozami IR. Za vsak citostatik smo iz krivulj preživetja določili inhibitorne koncentracije, z linearno-kvadratnim modelom pa smo izračunali inhibitorne doze IC30, IC50, IC70. V drugem delovnem sklopu smo celice in vitro tretirali z inhibitornimi dozami, nato pa ugotavljali izpostavljenost CRT na celični membrani s pretočnim citometrom. Sproščanje HMGB1 smo določili s testom ELISA, sproščanje ATP pa s testom za določanje luminiscence. Za določitev apoptoze in nekroze smo uporabili dve metodi. Pri prvi metodi smo celične linije in vitro tretirali z inhibitornimi dozami, nato pa za določanje uporabili pretočni citometer. Pri drugi metodi pa smo celice nasadili na ploščice, jih tretirali z inhibitornimi dozami, dodali fluorescentna reagenta ter s slikanjem v časovni seriji spremljali sproti obarvane apoptotične in nekrotične celice. Za določitev avtofagije smo celične linije in vitro tretirali z IC50, nato pa jih nasadili na plošče in inkubirali 24 ur. Za analizo smo uporabili test za določitev avtofagije, slike preparatov pa smo zajemali z mikroskopom. V zadnjem, tretjem delovnem sklopu smo določili spremembe v prisotnosti imunološko pomembnih membranskih označevalcev po obeh terapijah. S pretočnim citometrom smo preverili izražanje celičnih označevalcev MHC I, MHC II, PD-L1 ter CD40 v različnih časovnih točkah po tretiranju z inhibitornimi dozami in vitro. Rezultati: V prvem delovnem sklopu smo ugotovili, da so vse tri celične linije (B16-F10, 4T1, CT26) primerljivo permeabilne pri vseh testiranih napetostih ter so bile vse tri enako občutljive na CDDP in BLM ter IR. V drugem sklopu smo pokazali, da celice po EKT večinoma umrejo takoj, medtem ko celice po IR poskušajo nastale poškodbe DNA najprej popraviti in je celična smrt pravzaprav posledica neuspešnega popravila. V splošnem je EKT imela ugodnejše učinke na nastanek ICD tudi pri manj imunogenih celičnih linijah v primerjavi z IR, saj je povzročila ICD pri več linijah ter pri različnih koncentracijah, medtem ko se je pri IR to zgodilo samo pri celični liniji CT26. Nadalje smo določali pojav apoptoze in nekroze po obeh terapijah, kjer smo opazili, da se po EKT pojavita dva neodvisna vrhova, v katerih celice umirajo. Prvi se pojavi takoj po EKT, drugi pa 24 do 48 ur po EKT s prevladujočim nekrotičnim načinom umiranja, ne glede na vrsto citostatika ali celično linijo. Nasprotno pa smo opazili po IR, kjer so celice umirale šele v poznejših časovnih točkah, kjer je prav tako prevladovala nekroza. Pri vseh treh celičnih linijah se je število mrtvih celic višalo z višanjem doze ter daljšanjem časa po IR. V nadaljnjih poskusih smo povišanje avtofagije opazili samo pri celični liniji 4T1 po EKT s CDDP in BLM, nasprotno pa smo ugotovili, da se je avtofagija po IR znižala pri celični liniji B16-F10. Pri preučevanju sprememb v prisotnosti MHC I, MHC II, PD-L1 ter CD40 smo pokazali, da je EKT z vsemi tremi citostatiki sprožila povišanje izražanja MHC I in PD-L1 pri vseh treh celičnih linijah, izražanje MHC II pa se je znižalo pri vseh citostatikih, razen pri celični liniji B16-F10, kjer se je izražanje povišalo. V nadaljevanju smo pokazali, da molekulo CD40 izraža samo celična linija 4T1, pri kateri se je izražanje CD40 povišalo po EKT z vsemi citostatiki, razen pri koncentracijah IC30 in IC50 BLM. Tudi IR je povišalo izražanje molekul MHC I pri vseh treh celičnih linijah ter vseh dozah sevanja, razen pri celični liniji 4T1 pri dozi IC30. Tudi izražanje PD-L1 se je povišalo pri vseh treh linijah in dozah, pri 4T1 pa tudi CD40. Pri molekuli MHC II smo največ sprememb ugotovili pri celični liniji B16-F10. Zaključki: V raziskavi smo dokazali, da EKT s klinično pomembnimi citostatiki CDDP, OXA in BLM izzove različne imunološko pomembne spremembe v tumorskih celicah in vitro, odvisno od vrste citostatika, njegove koncentracije ter tumorskega modela. Pokazali smo tudi, da IR povzroči primerljive spremembe v izražanju celičnih površinskih označevalcev MHC I, MHC II, PD-L1 in CD40, vendar to ni časovno usklajeno s spremembami po EKT. EKT je sprožila največ sprememb v izražanju z ICD povezanih molekul DAMP (CRT, HMGB1, ATP) pri manj imunogeni celični liniji 4T1, IR pa je sprožilo največ sprememb v izražanju z ICD povezanih molekul DAMP pri najbolj imunogeni celični liniji CT26. EKT s klinično pomembnimi citostatiki CDDP, OXA in BLM zato lahko uvrstimo na seznam terapij, ki sprožijo ICD in vitro. Z našimi rezultati smo omogočili mehanističen vpogled v to, kako izkoristiti potencial ICD, da se sproži sistemski protitumorski imunski odziv, še posebej ko EKT kombiniramo z imunoterapijo.20242024-05-24 07:15:06Doktorsko delo/naloga156398VisID: 26320sl