Priprava modelnih mikrobnih združb za raziskave diverzitete z visokozmogljivim sekvenciranjemZaman, Jure (Avtor) Turk, Martina (Mentor) glivna modelna združbasekvenciranje amplikonovITSstandardZa preučevanje mikrobnih združb v veliki meri uporabljamo visokozmogljiva sekvenciranja z analizo pridobljenih nukleotidnih zaporedij. Najpogosteje uporabljana metoda za take analize je sekvenciranje pomnožkov (angl. Amplicon Sequencing). Ta omogoča sekvenciranje delov specifičnih genov, ki služijo kot taksonomski označevalci, to so tako imenovane črtne kode DNA (angl. DNA Barcode). Poglavitni taksonomski označevalci, ki jih pri uporabljamo, so geni za rRNA (16S rDNA za prokarionte in 18S rDNA ter notranji prepisani vmesnik (ITS) za evkarionte). Metoda je sestavljena iz več zaporednih korakov: izolacije DNA, pomnoževanja delov specifičnih genov z verižno reakcijo s polimerazo (PCR), sekvenciranja le-teh in bioinformatske obdelave podatkov. Vsak korak v tem procesu lahko povzroči pristranskost, kar vodi do napačnih zaključkov. Da bi se temu izognili, je potreben dober referenčni standard. Modelna mikrobna združba (MC) je standard z znano vrstno in številčno sestavo mikrobov. Pripravili smo modelno združbo, sestavljeno iz trinajstih vrst gliv in sicer v dveh oblikah, iz samih celic in iz izolirane DNA. Celično MC smo pripravili v dveh kombinacijah, kot mešanico, kjer je bila vsaka vrsta zastopana v enakem številu celic (enakomerna MC), ter kot mešanico, kjer so bile vrste zastopane v različnem številu (vrednosti desetiškega logaritma; logaritemska MC). Testno združbo na osnovi DNA smo pripravili iz DNA čistih kultur, kjer smo iz definiranega števila celic ali spor izolirali DNA in jih nato združili. Glive smo najprej gojili, določili število celic, izbrano število celic mehansko lizirali in izolirali DNA. Uspešnost izolacije DNA smo preverili z gelsko elektroforezo in izmerili njeno koncentracijo. V celični MC in MC iz DNA smo nato s PCR pomnožili regijo ITS2, ki je taksonomski označevalec za taksonomsko identifikacijo gliv. Pomnoženo DNA smo nato sekvencirali. Dobili smo grafe relativne zastopanosti variant zaporedja pomnožkov posameznega seva znotraj MC. Prisotnosti nekaterih sevov v končnih rezultatih nismo zaznali, številni pa so se pojavili samo v sledeh. Uspešno smo pripravili MC gliv. Vseh taksonov nismo zaznali v vseh MC, prav tako vrste niso bile zastopane v pričakovanih razmerjih. Kljub temu lahko pripravljene MC uporabimo kot referenčni standard v raziskavah mikrobne diverzitete s HTS.[J. Zaman]20242024-04-06 07:15:07Magistrsko delo/naloga155553UDK: 579.222:577(043.2)VisID: 236405COBISS_ID: 193128707sl