Študij interakcij med izbranimi ligandi in katepsinom L v prisotnosti cinkovih(II) ionovMalenšek, Katja (Avtor) Turel, Iztok (Mentor) katepsin Linhibicija encimske aktivnosticinkovi(II) ioniKatepsini so skupina encimov, ki sodelujejo pri razgradnji proteinov s cepitvijo peptidnih vezi. Prisotni so pri vseh organizmih znotraj in izven celic ter tako vključeni v najrazličnejše fiziološke procese. V primeru napačne lokalizacije, odsotnosti ali nereguliranega delovanja igrajo pomembno vlogo tudi pri pojavu različnih bolezni in drugih patoloških stanj. Katepsine glede na katalitične aminokislinske ostanke, ki se nahajajo v aktivnem mestu, delimo na serinske, aspartatne in cisteinske proteaze. Pripadnik slednjih je tudi katepsin L. Gre za lizosomsko endopeptidazo, ki je v celici zadolžena za razgradnjo znotrajceličnih proteinov, zunaj pa igra pomembno vlogo pri resorpciji kosti in sproščanju ščitničnih hormonov. Encim povezujemo tudi s patološkimi procesi, kot so miofibrilna nekroza, miopatija, miokardna ishemija in proteinurija, ter razvoj in metastaziranje rakavih celic. V zadnjem času je pridobil posebno pozornost zaradi bolezni Covid-19, saj virusu, ki bolezen povzroča, s svojim delovanjem omogoča vstop v celico. Posledično katepsin L (kot tudi ostali katepsini) predstavlja pomembno tarčo za razvoj novih terapevtskih učinkovin. V okviru magistrske naloge smo se tako odločili preučiti interakcije med izbranimi ligandi in katepsinom L v prisotnosti cinkovih(II) ionov ter preveriti njihov vpliv na aktivnost encima. Vse izbrane spojine uvrščamo v skupine O,O-, N,O-, N,N- in N-ligandov z znano farmakološko uporabo, ki so že v preteklosti izkazale (potencialen) vpliv na encimsko aktivnost katepsinov. Preučili smo tudi vpliv sintetiziranih kompleksov, ki sem jih pripravila iz ligandov in različnih cinkovih(II) soli. V okviru študije sem izvedla teste stabilnosti in teste encimske aktivnosti. Teste stabilnosti sem izvedla z UV/VIS spektrofotometrijo, ki je pokazala in situ tvorbo kompleksa v primeru dodatka cinkove(II) soli pri kliokinolu, in 1H NMR, ki ni podala jasnejših zaključkov (o identiteti posamičnih zvrsti nalidiksinske kisline in izoniazida), razen tega, da so vse testirane zvrsti v pufrski raztopini skozi čas stabilne. V okviru testov encimske aktivnosti sem s fluorimetričnimi meritvami določala vpliv različnih zvrsti na encimsko aktivnost katepsina L. Teste sem izvedla v acetatnem pufru in pufru MES. Izbrani ligandi (z izjemo izoniazida) sami po sebi le delno inhibirajo encim, v primeru dodatka cinkovih(II) ionov v obliki soli pa pride do popolne inhibicije. Omenjeni trend je prisoten tako v različnih pufrih kot pri različnih vrstah uporabljenih cinkovih soli. Kljub temu pa še boljše inhibitorne lastnosti od (večine) kombinacij ligandov in cinkovih soli izkazujejo same cinkove(II) soli – predvsem ZnCl2 v acetatnem pufru – zaradi česar bi lahko sklepali, da ligandi s kompleksiranjem poslabšajo inhibitorne lastnosti cinkovih(II) ionov. Sodeč po vrednosti EC50 je najboljši inhibitor katepsina L kompleks kliokinola in Zn(OAc)2·2H2O v acetatnem pufru. Hillov koeficient je pri tem večji od 1, kar kaže na pozitivno kooperativnost vezave.20242024-03-04 10:00:01Magistrsko delo/naloga154813VisID: 18121COBISS_ID: 188000259sl