Vloga gena za haptoglobin in parametrov hemolize pri oblikovanju tlečih lezij in njihova povezava z debelino plasti mrežnice pri multipli skleroziKrajnc, Nik (Avtor) Šega Jazbec, Saša (Mentor) Špiclin, Žiga (Komentor) multipla sklerozatleče lezijedebelina plasti mrežnicehaptoglobinparametri hemolizeželezoUvod. Tleče lezije predstavljajo kronično aktivne lezije, ki so povezane z višjo stopnjo prizadetosti bolnikov z multiplo sklerozo (MS) in hitrejšim napredovanjem v sekundarno napredujočo obliko. Dejavniki, ki prispevajo k njihovemu nastanku, ter njihova povezava z debelino plasti živčnih vlaken mrežnice (angl. peripapillary retinal nerve fiber layer, pRNFL), plasti ganglijskih celic ter notranje pleksiformne plasti (angl. ganglion cell-inner plexiform layer, GCIPL) ter notranje jedrne plasti (angl. inner nuclear layer, INL) ostajajo neraziskani. Cilji. Z doktorsko disertacijo smo želeli določiti vlogo gena oz. genotipa za haptoglobin ter parametrov hemolize pri nastanku tlečih lezij ter njihovo povezavo z debelino plasti mrežnice (pRNFL, GCIPL, INL). Dodatno smo se osredotočili na patofiziološke mehanizme privzema železa v mieloidne celice na obrobju tlečih lezij ter radiološki korelat hitrejšega napredovanja prizadetosti pri bolnikih s tlečimi lezijami. Metode. Opravili smo štiri nedovisne retrospektivne raziskave, v katere smo celokupno vključili 310 bolnikov z recidivno-remitentno in sekundarno napredujočo MS, ki so opravili 3T MRI glave po standardnem protokolu (T1-, FLAIR- in SWI-poudarjena sekvenca, v sklopu ene izmed raziskav pa tudi MDME-poudarjena [angl. multi-dynamic multi-echo] sekvenca). Parametri hemolize (število eritrocitov, število retikulocitov, koncentracija hemoglobina, hematokrit, koncentracija kalija, koncentracija železa, koncentracija bilirubina, koncentracija prostega hemoglobina, indeks hemolize, koncentracija laktat dehidrogenaze, koncentracija fibrinogena, koncentracija aspartat transaminaze) so bili določeni ob odvzemu krvi. Iz krvi bolnikov z MS smo izolirali DNA, genotip za haptoglobin pa smo določili z alelnim pomnoževanjem z verižno reakcijo s polimerazo. V vzorcih likvorja novodiagnosticiranih bolnikov je bila določena koncentracija topnega CD163 (sCD163). Za določitev povezave med številom tlečih lezij in debelino plasti mrežnice so bolniki opravili optično koherenčno tomografijo (OCT). Za določitev patofizioloških mehanizmov privzema železa v mieloidne celice na obrobju tlečih lezij smo vzorce možganskega tkiva, pridobljene ob obdukciji 18 kontrol in 24 bolnikov z MS, fiksirali v formalinu in vdelali v parafin. Za zaznavanje železa je bilo uporabljeno barvanje z diaminobenzidinom, okrepljeno s Turnbull modrim. Imunoreaktivnost železa, receptorja za transferin (TfR), SCARA5 (angl. Scavenger Receptor Class A Member 5), DMT1 (angl. divalent metal transporter 1), NRAMP1 (angl. natural resistance-associated macrophage protein 1), CD163, feroportina, hefestina in hepcidina je bila določena na zaporednih delih tkiva. Proučena so bila naslednja področja zanimanja: bela možganovina kontrol, bela možganovina normalnega izgleda (angl. normal-appearing white matter, NAWM) v oddaljenosti ? 10.000 µm od katere koli lezije, bela možganovina v okolici aktivnih lezij ter zgodnja in pozna aktivna področja. Pri kronično aktivnih lezijah smo proučevali okolno belo možganovino, rob lezij in neaktivna jedra lezij. MRI značilnosti (T1- in T2-relaksacijski čas, gostota protonov) so bile določene v tlečih lezijah, lezijah z difuznim SWI-hipointenzivnim signalom (DSHLs) ter SWI-izointenzivnih lezijah (SILs), okolni beli možganovini (angl. periplaque area, PPA) ter NAWM. Rezultati. Parametri hemolize se niso razlikovali med bolniki s tlečimi lezijami, brez le-teh (ne glede na spol in/ali potek bolezni) in kontrolami, prav tako nismo ugotavljali povezave med parametri hemolize in številom tlečih lezij. Parametri hemolize so ostali stabilni v času opazovanja ne glede na klinično in/ali radiološko aktivnosti bolezni. Porazdelitev genotipov za haptoglobin je bila v Hardy-Weinbergovem ravnovesju: Hp1-1 (n = 8; 8,2 %), Hp2-2 (n = 39; 39,8 %) in Hp2-1 (n = 51; 52,0 %). Moški spol (OR 3,83; 95 % CI 1,44, 10,19; p = 0,007) in daljše trajanje bolezni (OR 1,10; 95 % CI 1,00, 1,22; p = 0,044) sta bila neodvisno povezana z večjo verjetnostjo za prisotnost tlečih lezij, medtem ko starost, EDSS in genotip za haptoglobin niso bili. Koncentracija sCD163 je bila pri bolnikih s ? 4 tlečimi lezijami pomembno višja v primerjavi z bolniki s ? 3 tlečimi lezijami (p = 0,009) in je bila neposredno povezana s številom tlečih lezij (r2 = 0,14; p = 0,023). Bolniki s ? 4 tlečimi lezijami so imeli tanjši pRNFL (85,5 µm [15,5] proti 97,7 µm [12,0]; p < 0,001) in GCIPL (63,2 µm [9,1] proti 67,7 µm [6,5]; p = 0,039) ter debelejšo INL (35,9 µm [2,3] proti 34,3 µm [2,6]; p = 0,027) v primerjavi z bolniki brez le-teh. V multivariatnem modelu linearne regresije je bilo višje število tlečih lezij povezano s tanjšima pRNFL (ß = -0,18; 95 % CI -0,98, -0,03; p = 0,038) in GCIPL (ß = -0,21; 95 % CI -0,58, -0,02; p = 0,039), kar ni veljalo za INL (ß = 0,21; 95 % CI -0,01, 0,20; p = 0,073). V poznih aktivnih območjih in na obrobju kronično aktivnih lezij smo ugotavljali kopičenje mieloidnih celic, pozitivnih za železo. V poznih aktivnih območjih je bilo vzporedno s tem povečano število mieloidnih celic, ki so bile pozitivne za označevalce privzema železa TfR, DMT1 (SLC11A2), NRAMP1 (SLC11A1), SCARA5 in CD163, medtem ko je bilo na obrobju kronično aktivnih lezij pomembno povečano le izražanje DMT1 in CD163. Na obrobju kronično aktivnih lezij smo prav tako ugotavljali povečano število CD68+ in CD163+ mieloidnih celic, ki so korelirale z nakopičenim železom (CD163 [r2 = 0,0496; p = 0,033], CD68 [r2 = 0,3527; p < 0,001]). Število CD163+ mielodnih celic je koreliralo z izražanjem HMOX1 (r2 = 0,1495; p = 0,003). V celotni kohorti so imele tleče lezije daljše T1-relaksacijske čase v primerjavi z DSHLs in SILs (2.030,5 ms [1.519–2.540] proti 1615,8 ms [1403,3–1953,5] proti 1.199,5 ms [1.089,6–1.334,6]; oboje p < 0,001), DSHLs pa so imele daljše T1-relaksacijske čase v primerjavi s SILs (p < 0,001). T1-relaksacijski časi v PRL PPA so bili v vseh skupinah pomembno daljši v primerjavi s SIL PPA ter NAWM, ne pa tudi DSHL PPA. T2-relaksacijski časi v PRL PPA so bili v vseh skupinah pomembno daljši v primerjavi z NAWM, pri bolnikih z zgodnjo in pozno RRMS pa tudi v primerjavi z DSHL PPA in SIL PPA. Gostota protonov v PRL PPA je bila v vseh skupinah pomembno večja v primerjavi s SIL PPA in NAWM, pri bolnikih z SPMS pa tudi v primerjavi z DSHL PPA. Zaključki. V doktorski disertaciji smo ovrgli hipotezo, da parametri hemolize skupaj z genotipom za haptoglobin igrajo pomembno vlogo pri nastanku tlečih lezij. Dokazali smo, da je število tlečih lezij neposredno povezano z debelino plasti mrežnice. Poleg tega smo v mieloidnih celicah na obrobju tlečih lezij dokazali povečano izražanje proteinov, ki sodelujejo pri transportu in presnovi hemskega železa, kar govori v prid perifernemu izvoru železa v tovrstnih celicah. Nenazadnje smo pokazali, da so tleče lezije povezane z difuzno okvaro okolne bele možganovine, ki bi lahko predstavljala gonilni mehanizem t.i. tihega napredovanja prizadetosti. Z disertacijo smo tako odprli pomembno vprašanje, ali bi lahko tleče lezije služile kot terapevtska tarča za preprečevanje nadaljnje nevroaksonske okvare.20242024-03-02 07:15:08Doktorsko delo/naloga154792VisID: 26257sl