Vpliv mutacij E475G in P25L v keratinu 5 na fenotip keratinocitov gojenih v celični kulturiCvetkovska, Janina (Avtor) Liović, Mirjana (Mentor) Keratin 5keratinocitikožabulozna epidermoliza simplekstogost celične membraneagregatitkivni model kožeKeratini (K) so največja skupina intermediarnih filamentov. Zaradi svoje strukture se organizirajo v navite dimere. K5 tvori heterodimerne strukture s K14 in v veliki meri se izražata v bazalnih keratinocitih v epidermisu kože. Njuna glavna vloga je fizična stabilnost epidermisa. Določene mutacije v K5 ali K14 povzročajo bolezen, imenovano bulozna epidermoliza simpleks (EBS), katere značilnost je povišana krhkost kože in tvorba mehurjev. V magistrskem delu nas je zanimalo, kako na značilnosti keratinocitov, gojenih v celični kulturi, vpliva mutacija E475G v K5, ki povzroča hudo obliko EBS, in P25L v K5, ki povzroča blažjo obliko EBS z lisasto pigmentacijo. Uporabili smo celično linijo NEB-1, v katero je bil vstavljen konstrukt EGFP-K5, bodisi divji tip (WT), E475G ali P25L. Nameravali smo s klonsko selekcijo priti do klonov, kjer se bi omenjen konstrukt izražal v določenem deležu glede ne endogeni K5 in takšne klone medsebojno primerjati. S pomočjo NaDS-PAGE in prenosa po Westernu smo ugotovili, da smo imeli na voljo le klone, ki so izražali konstrukt v približno enaki, nizki količini. Z optično pinceto smo izmerili togost celičnih membran in ugotovili, da noben izmed konstruktov ne vpliva na togost membran. Ugotovili smo, da konstrukt EGFP-K5 E475G, tudi če je prisoten v majhni količini, povzroča povišano spontano tvorbo agregatov in ne le na periferiji celic. To je v nasprotju z našimi predvidevanji, saj v predhodnih študijah ni bilo potrjeno, da celice z mutacijo E475G zmotijo dinamiko keratinskega citoskeleta na ta način, da se poviša spontana tvorba agregatov. Pri teh celicah smo zaznali povišano izražanje K16 in K19. Oblikovali smo tkivne modele kože s keratinociti različnih celičnih linij. Izstopal je tkivni model s celicami EGFP-K5 E475G, kjer smo zaznali številne prazne prostore tako med dermisom in epidermisom, kot tudi med celicami epidermisa, kar je značilno za hudo obliko EBS in nakazuje na pomembno vlogo keratinskih filamentov pri adheziji.[J. Cvetkovska]20242024-01-25 07:15:19Magistrsko delo/naloga154093UDK: 547.962.9:616.529.1(043.2)VisID: 236218COBISS_ID: 182556163sl