Tvorba kompleksnih struktur iz tetraedrskih proteinskih nanokletk z uporabo sistema SpyCatcher/SpyTagPavko, Neža (Avtor) Gradišar, Helena (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) ovite vijačniceproteinski origamiSpyCatcherSpyTagProteinski origami iz ovitih vijačnic je eden izmed pristopov de novo načrtovanja proteinov, ki temelji na modularnosti in daljnosežnih interakcijah med posameznimi segmenti proteina. Do sedaj so bili uspešno načrtovani in okarakterizirani proteinski origamiji v velikosti do 100 kDa v obliki tetraedra, štiristrane piramide, bipiramide in tristrane prizme. Pri načrtovanju še večjih proteinskih origamijev v velikosti nekaj 100 kDa je glavna omejitev omejen nabor seta ortogonalnih ovitih vijačnic, ki predstavljajo osnovo nanokletk. Cilj tega magistrskega dela je bil razviti novo strategijo načrtovanja večjih struktur na osnovi do sedaj razvitih struktur proteinskega origamija in možnosti predstavitev proteinskih domen na njihovih ogliščih. Proteinski origami v obliki tetraedra TET12SN smo nadgradili z integracijo sistema SpyCatcher/SpyTag, ki ima sposobnost tvorbe izopeptidne vezi. Sprva smo načrtovali osnovne gradnike sistema, pri čemer smo oglišča TET12SN dekorirali z eno, dvema, tremi ali štirimi domenami SpyCatcher ali SpyTag. Vsi konstrukti, dekorirani s proteinsko domeno SpyCatcher v ogliščih, so ohranili katalizno aktivnost, ki jo ima prosta domena SpyCatcher, medtem ko je konstrukti z domenami SpyTag, vezanih na istih mestih, niso. Zato smo eksperimentalno identificirali optimalna mesta za vstavitev proteinske domene SpyTag z ozirom na ohranjanje aktivnosti in tako načrtovali TET12SN, dekoriran z eno, dvema, tremi ali štirimi domenami SpyTag. Po uspešni izolaciji in karakterizaciji vseh osnovnih konstruktov z analitsko kromatografijo z ločevanjem po velikosti, meritvami cirkularnega dikroizma, sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih in nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo smo nadaljevali s sestavljanjem kompleksnih struktur. Pri tem smo med seboj kombinirali različne osnovne konstrukte, kjer smo za centalno ogrodje uporabili osnovni konstrukt z različnim številom domen SpyCatcher ali SpyTag, kot ligandno ogrodje pa osnovni konstrukt z eno parno domeno - SpyTag ali SpyCatcher. Osnovni gradniki so se povezali z izopeptidnimi vezmi, nastale komplekse pa smo okarakterizirali z analitsko kromatografijo z ločevanjem po velikosti, nativno poliakrilamidno gelsko elektroforezo, poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata ter sipanjem rentgenskih žarkov pri nizkih kotih. Uspešno smo potrdili nastanek in obliko mono-, di-, tri- in tetrakonjugiranih kompleksov, pri čemer je bilo osrednje ogrodje dekorirano s proteinsko domeno SpyCatcher ali SpyTag. Tako načrtovani kompleksi so največji do sedaj opisani proteinski origamiji, pri čemer je molekulska masa najmanjšega tovrstnega okarakteriziranega konjugiranega kompleksa 170 kDa, masa največjega pa presega 400 kDa. Sistem, razvit tekom magistrskega dela, bi v nadaljevanju lahko nadgradili z integracijo drugih komponent (npr. nanoteles, antigenov, encimov ali drugih vezavnih domen) in na ta način naredili korak bližje funkcionalizaciji proteinskega origamija za medicinske ali industrijske aplikacije.20232023-11-06 14:15:01Magistrsko delo/naloga152120VisID: 21944COBISS_ID: 176568323sl