Študija angiogeneze na ravni proteinov in mRNA v plazmi in tkivu bolnic z rakom endometrijaRoškar, Luka (Avtor) Smrkolj, Špela (Mentor) Lanišnik Rižner, Tea (Komentor) biološki označevalciangiogenezarak endometrijaangiogeni faktorjiTie-2G-CSFleptinIL-8strojno učenjeizražanje genovRak endometrija (RE) je najpogostejši ginekološki rak v razvitih državah, pojavnost pa še narašča. Znano je, da angiogeneza, proces tvorbe novih žil, omogoča raku hitro rast in širitev v okolno tkivo. V zgodnjih fazah nastanka raka pride do sproščanja pro-angiogenih in zaviranja anti-angiogenih faktorjev (AF), kar predstavlja potencial za odkrivanje novih bioloških označevalcev za natančnejšo zgodnjo neinvazivno diagnozo in predoperativno stratifikacijo ter pravilno izbiro terapevtskih možnosti pri pacientkah z RE. Hkrati pa bi potrjevanje izražanja genov AF neposredno v tumorskem tkivu lahko izboljšalo poznavanje etiologije ter klasifikacije RE. Raziskovanje procesov angiogeneze pri RE smo razdelili na tri zaporedno povezane faze. Najprej smo v prospektivni monocentrični pilotni raziskavi, v katero je bilo vključenih 76 pacientk po menopavzi (38 pacientk z endometrioidnim RE in 38 kontrolnih pacientk z benignimi ginekološkimi obolenji), analizirali plazemske koncentracije 37 različnih AF ter ovrednotili diagnostični in prognostični potencial bioloških označevalcev raka endometrija. Koncentracije AF v predoperativnih vzorcih plazme so bile izmerjene s tehnologijo visokozmogljive ELISE Luminex xMAP?. Plazemske koncentracije sTie-2 in G-CSF so bile pri pacientkah z RE v primerjavi z osebami kontrolne skupine pomembno nižje, plazemske koncentracije leptina pa so bile pri pacientkah s RE pomembno višje kot v kontrolni skupini pacientk. Plazemske koncentracije nevropilina-1 so bile višje pri pacientkah s slabo diferenciranim RE v primerjavi z ostalimi pacientkami z RE ter kontrolno skupino pacientk. Koncentracije folistatina so se izkazale višje pri pacientkah z limfovaskularno invazijo, plazemske koncentracije IL-8 pa so bile bistveno višje pri pacientkah z metastazami. V fazi validacije smo nato analizirali plazmo 202 pacientk, od katerih je bilo 91 diagnosticiranih z RE in 111 z benigno ginekološko boleznijo. Z Luminex xMAP ? tehnologijo smo izmerili predoperativne koncentracije šestih, na podlagi pilotne raziskave izbranih AF: leptina, IL-8, sTie-2, folistatina, nevropilina-1 in G-CSF. Plazemske koncentracije leptina so bile pri pacientkah z ER pomembno višje kot pri kontrolnih pacientkah. Leptin je bil višji pri pacientkah z RE tipa 1, medtem ko je bil IL-8 višji pri RE tipa 2, zlasti pri slabo diferenciranem endometrioidnem RE. Plazemske koncentracije IL-8 so bile pri pacientkah z RE, pri katerih je bila prisotna limfovaskularna (LVI) ali miometrijska invazija (MI), pomembno višje. Zraven osnovnih statističnih metod smo z metodami strojnega učenja razvili diagnostične modele, ki temeljijo na koncentracijah testiranih AF. Med univariantnimi modeli je, tako v množici podatkov za trening, kot tudi v testni množici, dosegel najboljše rezultate model, ki temelji na leptinu. Kombinacija starosti, IL-8, leptina in G-CSF se je izkazala kot najpomembnejša skupina dejavnikov v multivariantnem modelu z ROC AUC 0,94 na trening- in 0,81 na testni množici. Model, ki uporablja kombinacijo vseh šestih AF, BMI in starosti, je dosegel ROC AUC 0,89 na obeh množicah, kar nakazuje na visoko sposobnost tega modela za napovedovanje tveganja za prisotnost RE. Raziskovanje angiogeneze pri RE smo nadaljevali na ravni izražanja genov za AF. Pregledali smo javno dostopne nabore podatkov v zbirkah The Cancer Genome Atlas (TCGA) in Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) za izražanje genov in proteinov povezanih z angiogenezo ter za nadaljnjo validacijo izbrali devet genov z več kot 3-kratno razliko v izražanju genov in hkrati z več kot 2-kratno razliko v koncentraciji proteinov med tkivom raka endometrija (T) in okolnim nerakavim tkivom endometrija (TA). V nadaljnjo analizo smo vključili še šest genov AF, ki smo jih predhodno izbrali na podlagi rezultatov naših prejšnjih raziskav (CSF3, IL8, LEP, NRP1, TEK, FST). Skupaj smo tako analizirali 15 genov z uporabo metode qPCR na skupini 36 pacientk z RE. V naši klinični kohorti sta bila gena IL8 in LEP pomembno bolj izražena, CXCL12, ENPP2, FBLN5, FGF2, LYVE1, PDGFRB, SERPINF1, TIMP2, TIMP3, NRP1 in TEK pa pomembno manj izraženi v T tkivu v primerjavi s TA tkivom. V zgodnjih fazah in nižjih gradusih RE, ne pa tudi v napredovalih stadijih ali agresivnejših oblikah RE, so bili geni za AF različno izraženi med T tkivom in TA tkivom. Geni so bili različno izraženi le v endometrijskem tkivu pacientk brez invazije v miometrij preko polovice (DMI) ali LVI. Ugotovili smo močnejše soizražanje genov v T tkivu kot v TA tkivu; korelacije so bile še posebej močne kadar je bila prisotna LVI. Pri ženskah po menopavzi z RE smo odkrili širšo vključenost genov, povezanih z angiogenezo, kot pri pacientkah v reproduktivni dobi. Nato smo z združitvijo podatkov iz naše raziskave ter TCGA razvili metodo modeliranja s strojnim učenjem za oblikovanje prognostičnega modela pri RE. Ustvarili smo prognostični model, ki razlikuje med RE nizkega in visokega gradusa na podlagi izražanja genov v tumorskem tkivu RE. Glede na naše rezultate je merjenje plazemskih koncentracij angiogenih faktorjev lahko pomembno dopolnilno diagnostično orodje za zgodnje odkrivanje in prognostično karakterizacijo RE. Naši podatki kažejo, da angiogenezo pri RE spodbuja predvsem zmanjšano izražanje genov antiangiogenih dejavnikov. Pri RE s prognostično manj ugodnimi značilnostmi je uravnavanje genov AF spremenjena tako v T tkivu kot v morfološko normalnem okolnem endometrijskem tkivu. Ugotovitve naših raziskav kažejo, da bi lahko plazemske ravni 6 različnih AF služile kot obetavni biološki označevalci ter diagnostično in prognostično orodje za zgodnje odkrivanje in karakterizacijo RE, zlasti, ko so vključeni v statistični model strojnega učenja. Ob tem ugotavljamo, da angiogenezo pri RE spodbuja predvsem zmanjšano izražanje genov anti-antiangiogenih molekul. Razultati nakazujejo spremenjeno izražanje AF ne samo v tumorskem ampak tudi v morfološko normalnem okolnem tkivu ob prisotnosti prognostično slabših kliničnih značilnostih kot sta LVI in MI. Za vzpostavitev natančnejšega diagnostičnega in prognostičnega modela s pomočjo strojnega učenja, ki bi upošteval izražanje genov AF v tkivu EC, je potrebna nadaljnja večja multicentrična raziskava.20232023-10-29 07:15:07Doktorsko delo/naloga152055VisID: 25342sl